农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂及其制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110452852 A(43)申请公布日 2019.11.15

(21)申请号 2019107595.6(22)申请日 2019.08.26(83)生物保藏信息

CGMCC NO.15555 2018.04.04

(71)申请人 浙江省农业科学院

地址 310000 浙江省杭州市石桥路198号 申请人 浙江金华丰源农业科技有限公司(72)发明人 姚燕来　洪春来　蒋伯康　朱为静　

朱凤香　王卫平　(74)专利代理机构 杭州君度专利代理事务所

(特殊普通合伙) 33240

代理人 沈志良(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C05F 15/00(2006.01)

()发明名称

农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂及其制备方法(57)摘要

本发明公开了一种农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂，所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂的名称为甲基营养型芽孢杆菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15555，保藏日期为2018年4月4日。通过将该菌株制备的菌剂接于农贸市场生物质废弃物中，提高生物质废弃物中的纤维素降解菌数量，促进农贸市场生物质废弃物的发酵腐熟，缩短堆肥时间，提高处理效率，实现无害化。

C05F 17/00(2006.01)C12R 1/07(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页

CN 110452852 ACN 110452852 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.一种农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂，其特征在于，所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂的名称为甲基营养型芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.15555。

2.根据权利要求1所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂，其特征在于，所述农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂在堆肥中的应用。

3.根据权利要求1所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂，其特征在于，所述保藏菌株在纤维素富集培养基上，在30℃培养1天，菌落呈白色褶皱状，革兰氏染色阳性，细胞为长杆状，周生鞭毛，1.00～3.49μm；

所述纤维素富集培养基的配制：NaCl 6.0g,MgSO4.7H2O 0.1g,KH2PO4 1g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 10.0g,(NH4)2SO4 2.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法至少包括以下步骤，

A、采样：从浙江金华、武义的富含纤维素的腐殖土、堆肥中采集样品，所述的采样时间为2016年；

B、菌株分离：利用纤维素选择性培养基进行纤维素降解菌的分离，所述的纤维素选择性培养基分离方法为：(1)称取1g土样，加入带100ml纤维素富集培养基的500ml三角瓶中，振荡培养5天；(2)从(1)中吸取5ml，加入带45ml无菌水的250ml三角瓶中，即为10-1稀释度，如此连续稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀释度，取10-4，10-5，10-6稀释液各100μl涂布在刚果红纤维素培养基平板上；(3)选择20-200菌落数的培养皿进行挑取单菌落进行斜面培养，温度为28-30℃培养2-3天；(4)共取5个1g土样，每个土样重复上述(1)～(3)的步骤；最后分离到纤维素降解菌12株；

所述纤维素富集培养基的配制：NaCl 6.0g,MgSO4.7H2O 0.1g,KH2PO4 1g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 10.0g,(NH4)2SO4 2.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；

C、菌株选择：采用FPA酶活测定法、CMC酶活测定法对得到的菌株进行纤维素酶活性的比较，得到纤维素酶活性最高的菌株；

D、菌株复筛：将得到的菌株进行基因组提取，并用16S通用引物对菌株进行鉴定，确认该菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus PGJ-D(P)，分离该菌株的土壤样品来自浙江金华；

E、菌株PGJ-D(P)活化培养：将分离的PGJ-D(P)菌株斜面保藏物接种到细菌种子斜面培养基斜面，置于30℃培养箱中培养2天，然后作为接种物接种至细菌种子液体培养基，接种后将细菌种子液体培养基置于30℃振荡培养箱中培养2天；

所述细菌种子斜面培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；所述细菌种子液体培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；

F、制备微生物菌剂：将细菌种子液体培养基中的菌体用无菌水洗涤后作为接种液接种至发酵培养基中，于30℃培养2天，即得微生物菌剂；

所述发酵培养基的配制：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，CMC5.0g，K2HPO4 1.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃高压灭菌20min，将冷却后的培养基作为PGJ-D(P)的培养物。

2

CN 110452852 A

说　明　书

农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂及其制备方法

1/5页

技术领域

[0001]本发明涉及农业微生物领域，尤其涉及一种农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂及其制备 方法。背景技术

[0002]农贸市场生物质废弃物是城市生活垃圾的主要来源之一，据统计可占到城市生活垃圾的 5％以上。目前农贸市场生物质废弃物主要和其他生活垃圾混合收集、运输，采用填埋处理及 少量的焚烧处理。但与城市生活垃圾相比较，农贸市场生物质废弃物一般具有较高的含水率， 在85％以上，采用填埋处理空间占用大，同时会产生大量渗沥液，而焚烧处理则增加了辅助燃 料成本，容易产生二次污染，还浪费了其中所含的有机资源。因农贸市场生物质废弃物主要 为易发酵腐烂的菜叶、径、根及部分残次鱼肉等碎屑，纤维素等有机物比例高达95％左右，接 近城市生活垃圾的2倍，且易收集，具有更高的可生化性和可利用性，而且含有植物生长所 需的氮、磷、钾等大量营养元素及镁、铜、锌等多种微量原料，通过土地利用，不仅可增加 土壤有机质，改善土壤结构，减少温室气体排放，而且可部分替代化肥，补充氮、磷、钾等 营养元素，减少化肥施用，减少环境污染，有效的利用有机资源和有机养分，实现资源充分 循环。

[0003][0004]

堆肥化是目前城市有机生活垃圾处理的方法之一，是实现垃圾减量化、无害化、资源化 的重要方式。但常规堆肥依靠天然微生物接种，不仅启动时间长，发酵效率低，尤其对于富 含纤维素等难分解的物质发酵效率更低，使得农贸市场生物质废弃物堆肥化处理一直未能得 到广泛应用。微生物是堆肥发酵中最关键、最活跃的因素，利用特定的功能微生物开发堆肥 发酵菌剂加速堆肥发酵是当前研究和堆肥应用的热点。针对农贸市场生物质废弃物中的纤维 素等难分解物质，分离和筛选高效纤维素降解微生物，开发微生物发酵菌剂，可以促进纤维 素的分解，加速堆肥发酵，缩短堆肥周期，提高堆肥品质，降低农贸市场生物质废弃物处理 成本，增加农贸市场生物质废弃物的处理能力，提高农贸市场生物质废弃物资源化利用率， 保证资源化产品的品质。

发明内容

[0005]本发明提供了一种农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂及其制备方法。

[0006]本发明的目的是解决现有农贸市场生物质废弃物处理中所采用的常规堆肥依靠天然微生 物接种，不仅启动时间长，发酵效率低，尤其对于富含纤维素等难分解的物质发酵效率更低 的问题。

[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂， 所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂的名称为甲基营养型芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.15555。

[0008]所述农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂在堆肥中的应用。

3

CN 110452852 A[0009]

说　明　书

2/5页

所述保藏菌株在纤维素富集培养基上，在30℃培养1天，菌落呈白色褶皱状，革兰

氏染 色阳性，细胞为长杆状，周生鞭毛，1.00～3.49μm；所述纤维素富集培养基的配制：NaCl 6.0g, MgSO4.7H2O 0.1g,KH2PO4 1g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 10.0g,(NH4)2SO4 2.0g,蒸馏水1000mL， pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min。

[0010]农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂的制备方法至少包括以下步骤，[0011]A、采样：从浙江金华、武义的富含纤维素的腐殖土、堆肥中采集样品，所述的采样时间 为2016年；[0012]B、菌株分离：利用纤维素选择性培养基进行纤维素降解菌的分离，所述的纤维素选择性 培养基分离方法为：(1)称取1g土样，加入带100ml纤维素富集培养基的500ml三角瓶中， 振荡培养5天；(2)从(1)中吸取5ml，加入带45ml无菌水的250ml三角瓶中，即为10-1 稀释度，如此连续稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀释度，取10-4，10-5，10-6 稀释液各100μl涂布在刚果红纤维素培养基平板上；(3)选择20-200菌落数的培养皿进行 挑取单菌落进行斜面培养，温度为28-30℃培养2-3天；(4)共取5个1g土样，每个土样重 复上述(1)～(3)的步骤；最后分离到纤维素降解菌12株；[0013]所述纤维素富集培养基的配制：NaCl 6.0g,MgSO4.7H2O 0.1g,KH2PO41g,CaCl2 0.1g, CMC-Na 10.0g,(NH4)2SO4 2.0g,蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；[0014]C、菌株选择：采用FPA酶活测定法、CMC酶活测定法对得到的菌株进行纤维素酶活性的 比较，得到纤维素酶活性最高的菌株；[0015]D、菌株复筛：将得到的菌株进行基因组提取，并用16S通用引物对菌株进行鉴定，确认 该菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus PGJ-D(P)，分离该菌株的土壤样 品来自浙江金华；[0016]E、菌株PGJ-D(P)活化培养：将分离的PGJ-D(P)菌株斜面保藏物接种到细菌种子斜面培 养基斜面，置于30℃培养箱中培养2天，然后作为接种物接种至细菌种子液体培养基，接种 后将细菌种子液体培养基置于30℃振荡培养箱中培养2天；[0017]所述细菌种子斜面培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15-20g， 蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；[0018]所述细菌种子液体培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL， pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；[0019]F、制备微生物菌剂：将细菌种子液体培养基中的菌体用无菌水洗涤后作为接种液接种至 发酵培养基中，于30℃培养2天，即得微生物菌剂；[0020]所述发酵培养基的配制：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，CMC 5.0g，KH2PO4 1.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃高压灭菌20min，将冷却后的培养基作为PGJ-D(P) 的培养物。

[0021]本发明的有益效果是：通过将该菌株制备的菌剂接于农贸市场生物质废弃物中，提高生 物质废弃物中的纤维素降解菌数量，促进农贸市场生物质废弃物的发酵腐熟，缩短堆肥时间， 提高处理效率，实现无害化。附图说明

[0022]图1为菌株菌落形态照片和电镜照片。

4

CN 110452852 A

说　明　书

3/5页

具体实施方式

[0023]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

[0024]本发明所述的农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂，其特征在于，所述的农贸市场生物质 废弃物的发酵菌剂的名称为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus PGJ-D(P)，保 藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15555，保 藏日期为2018年4月4日。

[0025]所述农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂在堆肥中的应用。[0026]所述发酵菌剂的制备方法至少包括以下步骤，[0027]A、采样：从浙江金华、武义的富含纤维素的腐殖土、堆肥中采集样品5个，所述的采样 时间为2016年。[0028]B、菌株分离：利用纤维素选择性培养基进行纤维素降解菌的分离，所述的纤维素选择性 培养基分离方法为：(1)称取1g土样，加入带100ml纤维素富集培养基的500ml三角瓶中， 振荡培养5天；(2)从(1)中吸取5ml，加入带45ml无菌水的250ml三角瓶中，即为10-1 稀释度，如此连续稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀释度，取10-4，10-5，10-6 稀释液各100μl涂布在刚果红纤维素培养基平板上；(3)选择20-200菌落数的培养皿进行 挑取单菌落进行斜面培养，温度为28-30℃培养2-3天；(4)共取5个1g土样，每个土样重 复上述(1)～(3)的步骤；最后分离到纤维素降解菌12株。所述纤维素富集培养基的配制： NaCl 6.0g,MgSO4.7H2O 0.1g,KH2PO4 1g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 10.0g,(NH4)2SO4 2.0g,蒸 馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min。[0029]C、菌株选择：针对筛选到的纤维素降解菌，为比较其纤维素降解活性，测定了纤维素酶 活性。纤维素酶活性的测定原理是纤维素酶降解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖， 在碱性条件下与3,5—二硝基水杨酸(DNS)共热后能将其还原为棕红色的氨基化合物，在一定 范围内还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖的生成量就可 测定纤维素酶活力的高低。这里采用FPA酶活测定法、CMC酶活测定法对得到的菌株进行纤维 素酶活性的比较，得到纤维素酶活性最高的菌株。[0030](1)FPA酶活测定[0031]取粗酶液1mL，加入1mLpH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液，摇匀后投入一张50mg滤纸，50℃保 温30min，加入2.5mLDNS试剂，沸水中煮沸5min，冷却后定容到25mL，在520nm下比色，测 出OD值。[0032](2)CMC酶活测定[0033]取粗酶液1mL，加入1mL含1％CMC的pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液，混匀，50℃恒温水浴30min， 加入2.5mLDNS试剂，沸水中煮沸5min，冷却后定容到25mL，在520nm下比色。[0034]以上均以100℃沸水浴灭活5min的粗酶液为空白对照。酶活性单位均使用国际单位(IU)。 即1个酶活性单位定义为1mL纤维素酶液每分钟催化底物成1μmol葡萄糖所需的酶量，以IU ·mL-1表示。[0035](3)两种酶活测定方法的纤维素酶活性计算公式：

[0036]

5

CN 110452852 A[0037]

说　明　书

4/5页

(4)试剂配制如下：

[0039]1mg/mL葡萄糖标准溶液：称取105℃烘干至恒重的分析纯葡萄糖100mg，用蒸馏水溶 解，定容至100mL。该葡萄糖标准溶液在纤维素酶活性测定时作为还原糖的标准溶液。[0040]DNS试剂(二硝基水杨酸试剂)：称取酒石酸钾钠200g，溶于一定量的蒸馏水中，加热 至50℃，再依次加入3,5—二硝基水杨酸10.0g,氢氧化钠10.0g，苯酚2.0g，无水亚硫酸钠 0.5g，搅拌至完全溶解。冷却后用蒸馏水定容至1000mL。储于棕色瓶中，放置1周后使用。[0041]醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8)：A液：冰醋酸1.2mL，加蒸馏水至100mL；B液：醋酸钠 (NaAc/3H2O)2.72g，溶于100mL蒸馏水中，两者按2：3的比例混合使用；[0042]1％CMC-Na溶液：称取0.5g CMC-Na于烧杯中，加入20mL左右pH 4.8乙酸—乙酸钠缓 冲液加热至完全溶解，转移至50mL容量瓶中定容即可。[0043](5)不同菌株酶活性比较[0044]其中，纤维素酶活性最高的菌株即为PGJ-D(P)。

[0045]

[0038]

D、菌株复筛：将得到的菌株进行基因组提取，并用16S通用引物对菌株进行鉴定，确认 该菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus PGJ-D(P)，分离该菌株的土壤样 品来自浙江金华；[0047]E、菌株PGJ-D(P)活化培养：将分离的PGJ-D(P)菌株斜面保藏物接种到细菌种子斜面培 养基斜面，置于30℃培养箱中培养2天，然后作为接种物接种至细菌种子液体培养基，接种 后将细菌种子液体培养基置于30℃振荡培养箱中培养2天；[0048]所述细菌种子斜面培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15-20g， 蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；[0049]所述细菌种子液体培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水 1000mL，pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min；[0050]F、制备微生物菌剂：将细菌种子液体培养基中的菌体用无菌水洗涤后作为接种液接种 至发酵培养基中，于30℃培养2天，即得微生物菌剂；[0051]所述发酵培养基的配制：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，CMC5.0g，K2HPO4 1.0g，

6

[0046]

CN 110452852 A

说　明　书

5/5页

NaCl5.0g， 蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，121℃高压灭菌20min，将冷却后的培养基作为PGJ-D(P)的培养 物。

[0052]所述保藏菌株在纤维素富集培养基上，在30℃培养1天，菌落呈白色褶皱状，革兰氏染 色阳性，细胞为长杆状，周生鞭毛，1.00～3.49μm；所述纤维素富集培养基的配制：NaCl 6.0g, MgSO4.7H2O 0.1g,KH2PO4 1g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 10.0g,(NH4)2SO4 2.0g,蒸馏水1000mL， pH7.0～7.4，121℃高压灭菌20min。[0053]所述保藏菌株PGJ-D(P)的16S rDNA序列如序列表所示，序列比对结果：该菌株可以归 为甲基营养型芽孢杆菌。

7

CN 110452852 A

序　列　表

1/1页

序列表<110> 浙江省农业科学院；浙江金华丰源农业科技有限公司<120> 农贸市场生物质废弃物的发酵菌剂及其制备方法<130> 2019<160> 1<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 1453<212> DNA<213> 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)<400> 1aatctggtca ccttcggcgg ctggctccta aaggttacct caccgacttc gggtgttaca 60aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 120ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga 180actgagaaca gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc 240cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac 300cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa 360gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag 480aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 0gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc 600ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact 660catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct 720cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct 780acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt 840ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg 900cgagcccttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 960ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga 1020acggcacttg ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg 1080cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca 1200tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta 1260agtggtagcc gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat 1320tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac 1380ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt gcattatagc 1440tggccccaat tgt 1453

8

CN 110452852 A

说　明　书　附　图

1/1页

图1

9