山东医药２０１７年第５７卷第２１期 二甲双胍对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞ＳＲＥＢＰ一２ 与总胆固醇表达的影响 刘书东 。陈建波 ，马世瞻 ，黄玉芳 ，宫爱华 （１山东省荣军总医院，济南２５００１３；２山东大学附属省立医院） 摘要：目的探讨二甲双胍对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞调节胆固醇代谢关键转录因子固醇调节元件结合蛋白２ （ＳＲＥＢＰ￣）与总胆固醇表达的影响。方法 培养ＨｅｐＧ２细胞并以不同浓度二甲双胍分别处理ＨｅｐＧ２细胞后培养 ２４ ｈ。采用Ｍ３３＂法测量０、５、１０、１５ ｍｍｏ￣Ｌ二甲双胍处理ＨｅｐＧ２细胞０、８、２４ ｈ后的存活率，定量ＰＣＲ法检测 １５ ｍｍｏｌ／ＬＺ．甲双胍处理０、８、２４ ｈ后ＨｅｐＧ２细胞ＳＲＥＢＰ￣ｍＲＮＡ的表达，胆固醇氧化酶法测量１５ ｍｍｏ￣Ｌ二甲双 胍处理Ｏ、８、２４ ｈ后ＨｅｐＧ２细胞的总胆固醇水平。结果 随二甲双胍浓度增加、时间延长ＨｅｐＧ２细胞存活率降低 （Ｐ均＜０．０５）。二甲双胍作用于ＨｅｐＧ２细胞的最佳浓度为１５ ｍｍｏｌｆＬ、最佳时问点为２４ ｈ。１５ ｍｍｏＶＬ二甲双胍 干预２４ ｈ，ＨｅｐＧ２细胞内总胆固醇水平及ＳＲＥＢＰ￣ｍＲＮＡ表达与干预８ ｈ比较，Ｐ均＜０。０５。结论 二甲双胍可 抑制人肝癌ＨｅｐＧ２细胞ＳＲＥＢＰ－２的合成，降低细胞内总胆固醇水平。 关键词：２型糖尿病；二甲双胍；胆固醇；固醇调节元件结合蛋白２ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１７．２１．０１２ 中图分类号：Ｒ７８１．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１７）２１－００３９－０３ ２型糖尿病又称为糖脂病¨ｊ。相关研究显示， 大约８０％的２型糖尿病患者伴有血脂异常 Ｊ。二 甲双胍是治疗２型糖尿病的首选药物，其短期和长 继续培养２４ ｈ。 １．３细胞存活率测算采用ＭＴｒ法。取二甲双胍 期降糖疗效安全可靠 ］。研究发现，二甲双胍不仅 可以改善２型糖尿病的血糖紊乱，还可改善其脂质 代谢异常‘４ Ｊ，但目前对二甲双胍调节血脂的具体作 用机制研究甚少。本研究采用二甲双胍干预人肝癌 处理的ＨｅｐＧ２细胞培养基，每孔加入５ ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ 溶液２０ Ｌ；孵育４～６ ｈ。弃去培养基，加入二甲基 亚砜１５０ ＩｘＬ，置摇床上低速振荡１０ ｒａｉｎ，以酶联免 疫检测仪于４９０ ｎｍ处测量０、５、１０、１５ ｍｍｏｌ／Ｌ二甲 双胍处理０、８、２４ ｈ各孔的吸光度，计算不同浓度二 甲双胍处理０、８、２４ ｈ ＨｅｐＧ２细胞存活率。 １．４细胞ＳＲＥＢＰ一２ ｍＲＮＡ表达检测一ＨｅｐＧ２细胞，并观察其调节胆固醇代谢关键转录因 子固醇调节元件结合蛋白２（ＳＲＥＢＰ一２）与总胆固醇 表达的变化，旨在探索二甲双胍调节血脂代谢的新 靶点。 １材料与方法 应用ＴＲＩｚｏｌ 步法提取ＨｅｐＧ２细胞总ＲＮＡ；以１３一ａｃｔｉｎ为内参， 采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时定量ＰＣＲ技术检测ＳＲＥＢＰ． ２ ｍＲＮＡ表达。ＳＲＥＢＰ－２：上游引物５ 一ＣＡＣ— １．１细胞及试剂来源人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２购自 ＣＣＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＣ一３ ，下游引物５ ．ＴＣＣＧＣ— 上海中科院细胞库。ＲＰＭＩ１６４０培养基、胎牛血清购 自美国ＧＩＢＣＯ公司；二甲双胍盐酸盐、ＭＴＹ试剂盒 购自美国Ｓｉｇｍａ公司；ＳＲＥＢＰ－２引物、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、实时定量ＰＣＲ试剂盒购自Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ ＣＴＴＴＣＴＣＣＴｒＣ ｒｒｒＧ一３ ；Ｂ—ａｃｔｉｎ：上游引物５ 一 ＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＡＧ＿３ ，—Ｆ游弓Ｉ物５ 一ＣＴＧ— ＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧ－３ ，ＰＣＲ反应体系为５０ 公司；总胆固醇测定试剂盒购自南京森贝咖生物科 技有限公司。 按试剂盒说明书操作。计算１５ ｍｍｏｌ／Ｌ二甲双 胍处理０、８、２４ ｈ细胞ＳＲＥＢＰ－２ ｍＲＮＡ表达。 ，１．５ 细胞总胆固醇水平测定 采用胆固醇氧化酶 １．２细胞培养及二甲双胍处理ＨｅｐＧ２细胞在含 １Ｏ％胎牛血清的ＲＰＩＭ１６４０培养基中于３７℃、５％ 法。细胞分组培养后，用胰酶消化细胞，收集细胞到 无菌离心管，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，离心后弃上 清，以ＰＢＳ ２００ Ｌ匀浆。按照总胆固醇测定试剂盒 ＣＯ。培养箱中培养２４ ｈ。取培养ＨｅｐＧ２细胞计数 调整至１ Ｘ １０ ／ｍＬ，接种于９６孔板中，每孑Ｌ １００ ｔｘＬ， 在３７℃、５％ＣＯ：培养箱中培养２４ ｈ。吸去孔内培 养液，加入不同浓度（０、５、１０、１５ ｍｍｏｌ／Ｌ）二甲双胍 说明书加人试剂，以酶标仪于５２０ ＹＩｍ处测量０、５、 １０、１５ ｍｍｏｌ／Ｌ二甲双胍处理０、８、２４ ｈ各孑Ｌ的吸光 度，计算不同浓度二甲双胍处理０、８、２４ ｈ后ＨｅｐＧ２ ３９ 山东医药２０１７年第５７卷第２１期 细胞总胆固醇水平。 ２型糖尿病患者的血脂谱以混合型血脂紊乱多 １．６统计学方法采用ＳＰＳＳ１９．０统计软件。计量 见，表现为甘油三酯、胆固醇升高，高密度脂蛋白胆 资料用 ±ｓ表示，不同时间点数据比较采用单因素 固醇降低 』。二甲双胍是预防和治疗２型糖尿病的 方差分析，进一步两两比较采用ＬＳＤ一 检验。用简 经典、一线口服药物，具有良好的临床疗效及安全 单线性相关分析浓度、时间依赖性。Ｐ＜０．０５为差 性。除降糖作用外，二甲双胍还可改善血脂紊乱、减 异有统计学意义。 重、抗肿瘤、保护心血管作用 。国内徐巧红等 Ｊ ２ 结果 研究显示，二甲双胍治疗后２型糖尿病患者甘油三 ２．１二甲双胍不同浓度、不同处理时间对ＨｅｐＧ２ 酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显降 细胞存活率的影响ＨｅｐＧ２细胞存活率随二甲双 低，高密度脂蛋白胆固醇较前明显升高。但二甲双 胍浓度增加、时间增加而降低（Ｐ均＜０．０５）。二甲 胍改善血脂紊乱的具体机制尚未完全阐明。Ｘｕ 双胍作用于ＨｅｐＧ２细胞的最佳浓度为１５ ｍｍｏｌ／Ｌ、 等 研究显示，二甲双胍可通过激活腺苷酸活化蛋 最佳时间点为２４ ｈ。见表１。 白激酶（ＡＭＰＫ），抑制脂肪酸脱氢酶而导致低密度 表１二甲双胍不同浓度、不同处理时间ＨｅｐＧ２细胞 脂蛋白胆固醇降低。固醇调节元件结合蛋白家族是 存活率比较（％， ±ｓ） 重要的调节脂质代谢的核转录因子之一，包括 ＳＲＥＢＰ一１ａ、ＳＲＥＢＰ一１ｃ、ＳＲＥＢＰ－２三个亚型。而 ＳＲＥＢＰ一２是调节胆固醇合成的关键核转录因子，通 过下游靶蛋白胆固醇合成限速酶ｐ一羟基一ｐ一甲 基戊二酸单酰辅酶Ａ还原酶的表达直接影响胆固 醇的合成数量¨ 。二甲双胍可通过调节ＳＲＥＢＰ－１ ｃ 注：与相同浓度０、８ ｈ比较， Ｐ＜０．０５；与相同时ｆ司０、５、１０ 抑制脂肪酸合成¨ 。Ｌｉ等¨ 研究发现，二甲双胍 ｍｍｏｌ／Ｌ比较， Ｐ＜０．０５。 通过ＡＭＰＫ磷酸化ＳＲＥＢＰ．１ Ｃ和ＳＲＥＢＰ－２影响其向 ２．２二甲双胍对ＨｅｐＧ２细胞总胆固醇水平的影响 细胞核内转位，进而抑制脂肪酸和胆固醇的合成，改 用１５ ｍｍｏｌ／Ｌ二甲双胍分别处理ＨｅｐＧ２细胞０、 善血脂紊乱、胰岛素抵抗、动脉硬化。本研究亦显示 ８、２４ ｈ，ＨｅｐＧ２细胞总胆固醇水平分别为（３．８０± 二甲双胍可使ＨｅｐＧ２细胞的活性减弱，抑制 ０．２０）、（３．６５±０．３５）、（２．５６±０．３８）ｍｍｏｌ／Ｌ。０、８ ＳＲＥＢＰ．２的合成，降低细胞内总胆固醇浓度。 ｈ时ＨｅｐＧ２细胞内总胆固醇水平比较，Ｐ＞０．０５；２４ 综上所述，二甲双胍可能或部分通过抑制胆固 ｈ ＨｅｐＧ２细胞内总胆固醇水平与０、８ ｈ比较，Ｐ均＜ 醇合成关键核转录因子ＳＲＥＢＰ．２的合成降低胆固 ０．０５。 醇的合成，达到改善血脂紊乱、保护心血管的作用。 ２．３二甲双胍对ＨｅｐＧ２细胞ＳＲＥＢＰ．２ ｍＲＮＡ表达 但是，本文未补充动物试验，而且取材为肝癌细胞， 的影响 用１５ ｍｍｏｌ／Ｌ二甲双胍处理ＨｅｐＧ２细胞 与专属脂质代谢的细胞比较代表性不足，也部分影 ８、２４ ｈ，ＳＲＥＢＰ－２ ｍＲＮＡ相对表达量分别为０．８６± 响了结果的客观性与真实性。 ０．０７、０．３９ ４－０．１５。２４ ｈ时ＨｅｐＧ２细胞ＳＲＥＢＰ一 参考文献： ２ｍＲＮＡ相对表达量与８ ｈ比较，Ｐ＜０．０５。 ［１］张丽，高聆，梁军，等．棕榈酸对胰岛的脂毒性及非诺贝特的保 ３讨论 护作用［Ｊ］．中华内分泌代谢杂志，２００５，２１（２）：１５５—１５８． ２型糖尿病是当前威胁全球人类健康的重要代 ［２］中华医学会内分泌学分会．中国２型糖尿病合并血脂异常防治 谢性疾病。患者长期碳水化合物、血脂、蛋白质代谢 专家共识（２０１１年）［Ｊ］．中华内分泌代谢杂志，２０１２，２８（９）： ７００－７０３． 紊乱引起多系统损害，导致眼、肾、心脏、神经、血管 ［３］母义明，纪立农，宁光，等．二甲双胍临床应用专家共识（２０１６ 等组织器官的慢性进行性病变，功能减退及衰 年版）［Ｊ］．中国糖尿病杂志，２０１６，２４（１０）：８７１—８８４． 竭 Ｊ。高脂血症是２型糖尿病患者心血管并发症发 ［４］ｘｕ Ｔ，Ｂｒａｎｄｍａｉｅｒ Ｓ，Ｍｅｓｓｉａｓ ＡＣ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｏｎ 生的重要危险因素 Ｊ。英国前瞻性糖尿病研究的 ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ＬＤＬ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｐ￣ｉｅｍｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａ— 结果显示，血脂异常是糖尿病患者发生致死性和非 ｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，２０１５，３８（１ｏ）：１８５８—１８６７． 致死性心肌梗死的首要危险因素 ７１。因而及早发 ｆ５］中华医学会糖尿病学分会．中国２型糖尿病防治指南（２０１３年 版）［Ｊ］．中国糖尿病杂志，２０１４，８８（８）：２－４２． 现２型糖尿病患者血脂异常并给予早期干预对防治 ［６］Ｍｏｔｔｉｌｌｏ Ｓ，Ｆｉｌｉｏｎ ＫＢ，Ｇｅｎｅｓｔ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ 动脉粥样硬化、减少心脑血管事件、降低病死率具有 ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ・ａｎａｌｙｓｉｓ Ｊ］． 重要临床意义。 Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１０，５６（１４）：ｌｌ１３—１１３２． 山东医药２０１７年第５７卷第２ｌ期 牛蒡子苷元对大鼠脑胶质瘤细胞增殖 及其瘤体生长的抑制作用 张朝巍 （天津医科大学总医院滨海医院，天津３００４８０） 摘要：目的 观察牛蒡子苷元（ＡＲＧ）对大鼠脑胶质瘤细胞株ｃ６增殖及其瘤体生长的抑制作用。方法 常规 培养ｃ６细胞，分别加入不同浓度０．１、０．３、１．０、３、１０、３０、１００、３００ ｍｏＬ／Ｌ的ＡＲＧ作用４８ ｈ，采用ＭＴｒ法测算细胞 增殖抑制率及ＡＲＧ的半数抑制浓度（ＩＣ ）。将ｃ６细胞悬液注入ｓＤ大鼠脑组织制备脑胶质瘤模型，将模型随机 分为ＡＲＧ低、高剂量组及替莫唑胺（ＴＭＺ）组和对照组；ＡＲＧ低、高剂量组于ｃ６细胞移植后第２天分别给予０．１、 ０．３ ｍｇ／ｋｇ ＡＲＧ皮下注射，１次／ｄ，连续给药１６ ｄ；ＴＭＺ组于ｃ６细胞移植后第５天给予２０ ｍｇ／ｋｇ ＴＭＺ灌胃，１次／ｄ， 连续给药５ ｄ；对照组给予相应的溶媒。ｃ６细胞移植后第１７天测算脑胶质瘤体积及抑瘤率；取小鼠肿瘤组织，ＨＥ 染色后观察肿瘤病理形态；计算小鼠脾脏指数、胸腺指数并进行外周血常规检查。结果０．１、０．３、１．０、３、１０、３０、 １００、３００ ｍｏＬ／Ｌ的ＡＲＧ对ｃ６细胞的增殖抑制率分别为１９．２％、３２．６％、４７．５％、４３．１％、４２．８％、４８．０％，５７．４％、 ８４．４％，药物浓度越高细胞增殖抑制率越高（Ｐ＜０．０５）；ＡＲＧ的Ｉｃ５０为６７．８ ｍｏＬ／Ｌ。ＡＲＧ低剂量组、ＡＲＧ高剂量 组、ＴＭＺ组脑胶质瘤体积与对照组比较，Ｐ均＜０．０５；ＡＲＧ低剂量组抑瘤率与ＡＲＧ高剂量组比较，Ｐ＜０．０５。对照 组大鼠肿瘤细胞布满整个视野，呈浸润性增长；ＡＲＧ低、高剂量组肿瘤细胞排列致密程度较对照组稀疏，与ＴＭＺ组 一致。ＡＲＧ低、高剂量组胸腺指数、血小板计数及血小板压积与ＴＭＺ组比较，Ｐ均＜０．０５。结论 牛蒡子苷元可 抑制大鼠脑胶质瘤细胞增殖及其瘤体生长，且对机体免疫器官及血小板水平无明显不良影响。 关键词：脑胶质瘤；牛蒡子苷元；脑胶质瘤细胞株Ｃ６；大鼠 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２，２６６Ｘ．２０１７．２１．０１３ 中图分类号：Ｒ７３９．４１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１７）２１－００４１－０３ 脑胶质瘤的常规治疗包括手术、放疗和化疗，但 大鼠脑胶质瘤细胞增殖及其瘤体生长的抑制作用。 复发率极高。因此，在肿瘤缓解期采用维持治疗以 现报告如下。 。巩固疗效极为重要。化疗是维持治疗重要措施之 １材料与方法 一，但常用的化疗药物替莫唑胺（ＴＭＺ）不良反应 １．１动物、试剂及仪器来源ＳＤ大鼠７２只，体质 大，患者不耐受。牛蒡子来源于菊科两年生草本植 量（１６０±２０）ｇ，购自山东新时代药业有限公司。 物牛蒡，属牛蒡的干燥成熟果实。现代药理学研究 ＡＲＧ注射液购自山东新时代药业有限公司；ＴＭＺ购 发现，牛蒡子有抗病毒、抗炎、抗癌、抑制热休克反 自北京嘉瑞时代科技有限公司。大鼠脑胶质瘤细胞 应、疏风散热、解毒透疹和利咽消肿等功效，其主要 株ｃ６购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资 活性成分是牛蒡子苷元（ＡＲＧ） －２］。ＡＲＧ在动物 源中心。超净工作台购自苏净集团安泰公司；血液 体内有抗肺癌、胰腺癌、白血病的作用 －５１。２０１２ 分析仪购自美国雅培公司；倒置荧光显微镜购自日 年８月～２０１３年１Ｏ月，本研究探讨牛蒡子苷元对 本奥林巴斯公司；组织包埋机、全封闭组织脱水机购 ［７］Ｔｕｒｎｅｒ ＲＣ，Ｍｉｌｌｎｓ Ｈ，Ｎｅｉｌ ＨＡ，ｅｔ ａ１．Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｅｒｏｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００６，１２４（１）：３５－４６． ｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ：Ｕｎｉｔｅｄ ［１ １］Ｙａｐ Ｆ，Ｃｒａｄｄｏｃｋ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＡＭＰＫ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ：２３）［Ｊ］．ＢＭＪ， ＬＸＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｒｅｂｐ－ｌｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，２０１Ｉ，７ １９９８，３１￣（７１３４）：８２３—８２８． （５）：６４５－６５０． ［８］赵春云，赵玉芹，田敬荣，等．利拉鲁肽、二甲双胍治疗对２型糖 ［１２］Ｋ Ｙ，Ｘｕ Ｓ，Ｍｉｈａｙｌｏｖａ ＭＭ，ｅｔ ａ１．ＡＭＰＫ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎ— 尿病患者血脂水平的影响［Ｊ］．山东医药，２０１４，５４（１０）：９５－９６． ｈｉｂｉｔｓ ＳＲＥＢＰ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅ－ ［９］徐巧红，陈欢，彭辉，等．二甲双胍与阿卡波糖治疗ＩＧＴ后胰岛 ｒｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，２０１１， ｐ细胞功能、血脂谱的比较［Ｊ］．中华临床医师杂志（电子版）， １３（４）：３７６￣８８． ２０１６（７）：１５５—１５６． （收稿日期：２０１７－０１－２５） ［１Ｏ］Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ儿，ＤｅＢｏｓｅ．Ｂｏｙｄ ＲＡ，Ｂｒｏｗｎ ＭＳ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ４１
