人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

第18卷第3期2009年6月

中国组织化学与细胞化学杂志

CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEMISTRY

Vol1181No13Jun12009

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导

方法的对比研究

焦淑洁　许慧芳　杨华静1　许　杰　湛彦强　张苏明3

(华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科;1眼科,武汉　430030)

　　〔摘要〕　目的　探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体(embryonicbody,EB)法和直接分化法的不同效率。方法　人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组:A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT2PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT2PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果　RT2PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义(P<0101),且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论　在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。〔关键词〕　人胚胎干细胞;　细胞分化;　神经干细胞〔中图分类号〕　R34915　　〔文献标识码〕　A　　DOI:1013870/zgzzhx120091031001

DIFFERENTIATIONOFHUMANEMBRYONICSTEMCELLSINTONEURALSTEMCELLSINVITRO

JiaoShujie,XuHuifang,YangHuajing1,XuJie,ZhanYanqiang,ZhangSuming3

(DepartmentofNeurology,

1

DepartmentofOphthalmology,TongjiHospital,

HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

〔Abstract〕　ObjectiveToinvestigatethefeasibilityandefficiencyofdifferentiationofhumanembry2

onicstemcells(hESCs)intoneuralcellswithorwithoutaperiodofembryonicbody(EB)cultureinvitro1MethodsThehESCsweredigestedanddividedinto2groups:groupAunderwentEBculture,whilecellsingroupBwereinducedbynogginandITSFndirectlywithoutEBculture1Morphologicchangeswereob2servedunderinvertedmicroscope1ThedifferentmarkersweredetectedbyRT2PCR1NestinwasdetectedbyimmunofluorescenceandflowcytometryafterhESCsdifferentiated1Inthefurtherdifferentiationofneuralstemcens,MAP2andGFAPwereobservedbyimmunofluorescenceandRT2PCR1ResultsIngroupB,thepositiverateofnestinwashigherthanthatingroupA(P<0101)1ThecycletimeofgroupBwasshorterthanthatofgroupA1MAP2andGFAPweredetectedafterthedifferentiationofneuralstemcells1ConclusionThehESCscandifferentiateintoneuralcellswithoutEBcultureinvitro1Thismethodismoreefficientthanthetraditional1

〔Keywords〕　Humanembryonicstemcell;　Celldifferentiation;　Neuralstemcell　　体外成功诱导人胚胎干细胞分化为神经前体细胞,为Parkinsonπs病、肌萎缩性侧索硬化、脑和神经损伤等神经系统疾病的治疗带来了希望,成为现今研究热点。目前采用的诱导分化方法大致可分为三种:一是经拟胚体(embryonicbodies,EB)

〔收稿日期〕2008211204　〔修回日期〕2009202208〔作者简介〕焦淑洁,女(1976年),汉族,博士生。3通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed)

法[1];二是与具有特殊诱导能力的基质细胞(如

PA6,MS5细胞等)共培养法[2];三是用特定的诱导因子使胚胎干细胞直接定向分化法[3]。本研究对经EB法与直接诱导分化法进行比较,以探索适合临床应用的经济合理的诱导方法。

材料和方法

11材料

2　34　中国组织化学与细胞化学杂志第18卷

111　人胚胎干细胞(hESCs)及相应培养基

人胚胎干细胞系TJMU1和TJMU2,由本实验室与同济医院生殖中心前期研究人员陈红博士等人建系[4],本实验室保存。hESCs培养基:KnockoutDMEM(Gibco)、血清替代物(Gibco)、L2谷

β胺酰胺(Hyclone)、非必需氨基酸(Hyclone)、2

巯基乙醇(Sigma)、重组碱性成纤维细胞生长因子(basic2fibroblastgrowthfactor,bFGF)(Sig2ma)及青链霉素(Hyclone)。EB培养基:hESCs

化。倒置相差显微镜下观察各阶段细胞形态变化,并拍照记录。

212　细胞免疫荧光观察各阶段细胞标志性抗原表达

4%多聚甲醛固定预置在盖玻片上生长的细胞,一抗(抗nestin、抗MAP2、抗GFAP抗体)4℃过夜,FITC标记的二抗37℃孵育1h,DAPI染核。中性树胶封片,照相。各组细胞随机取3张爬片,观察10个视野,nestin阳性细胞率=阳性细胞数/DAPI复染细胞数。

213　RT2PCR检测

培养基去除bFGF。神经干细胞培养基:DMEM/F12(Hyclone)、B27(Gibco)、500ng/mlnoggin(R&D)、bFGF、非必需氨基酸、L2谷胺酰胺及青链霉素。直接分化神经干细胞培养基:DMEM/F12、300ng/mlnoggin、ITS(Sigma)、纤维连接

(Gibco)、B27、bFGF、蛋白(fibronectin,Fn)

非必需氨基酸、L2谷胺酰胺及青链霉素。神经元培养基:DMEM/F12、ITS(Sigma)、N2(Gibco)、脑源性神经营养因子(R&D)、表皮生长因子(R&D)、B27、L2谷胺酰胺、非必需氨基酸及青链霉素。胶质细胞培养基:神经元培养基中去除脑源性神经营养因子,添加血小板源生长因子(R&D)。

112　其他实验试剂

抗Nestin抗体(神经前体细胞特异性抗体)、抗微管相关蛋白22(anti2microtubule2associatedprotein2,MAP22,成熟神经元特异性抗体)多克隆抗体、抗胶质纤维酸性蛋白(anti2glialfibrillaryacidicprotein,GFAP,神经胶质细胞特异性抗体)单克隆抗体(Chemicon公司);DAPI(Sigma)、FITC标记的荧光二抗(北京中杉金桥);TrizolandRT2PCR试剂盒(Fermentas公司)。

21方法

211　hESCs培养、分化及实验分组

hESCs复苏后,接种于丝裂霉素灭活的胚胎

①提取总RNA。②合成cDNA,采用Fer2

mentasRT试剂盒,按产品说明书操作。③聚合酶链反应,GAPDH作为内参照。214　流式细胞仪检测胰酶消化细胞为单细胞悬液,2%台盼蓝染色,计数活细胞率。选取活细胞率为80%以上的样本。按活细胞比例计算并收集1×106个活细胞,2000r/min离心5min,80%冰乙醇固定,0125%Triton2X100破膜,一抗(抗nestin抗体)4℃过夜,FITC标记的二抗室温孵育30min,PBS重悬细胞,流式细胞仪检测两组细胞Nestin的阳性率(%)。各组实验重复3次。

31统计学处理

Nestin的阳性率(%)用x󰁫±s表示,应用SPSS1110软件包中的t检验对数据进行分析。

结　　果

11hESCs和拟胚体的一般形态及诱导细胞的

形态

相差显微镜下观察,hESCs呈巢式生长,克隆大而扁平,细胞核大,核质比高,核仁清楚呈单个或双个核仁,细胞间界限清楚、折光性强,见图1。hESCs经EB阶段,6d左右形成简单拟胚体,细胞团体积较大,结构紧密,透明度高,细胞间粘附性强,见图2。

21细胞免疫荧光鉴定分化细胞特征及细胞阳性率的比较

(1)荧光显微镜下,B组加入直接分化培养基后,48h可见散在Nestin阳性小团状细胞的出现,如图3a所示。经过诱导分化,两组得到的神经干细胞Nestin染色阳性,见图3b。A组Nestin阳性细胞率为6913%±3143%,B组Nestin阳性细胞率为79111%±6119%,两组相比,差异有统计学

鼠成纤维细胞饲养层上,加入hESCs培养基,置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养,第627d

时脱离饲养层,机械法传代。传代后细胞分为A、B组进行实验。A组采用经EB法,EB培养基进行悬浮培养6210d后,加入神经干细胞培养基进行诱导分化14d,隔天换液。B组不经EB悬浮培养,直接将消化传代的hESCs接种于培养瓶中,加入直接分化培养基诱导分化12214d,223d换液一次。之后两组细胞置于预先铺被多聚赖氨酸的培养板中,分别加入神经元、胶质细胞培养基继续诱导分

　第3期焦淑洁等1人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究235　意义(P<0101)。

(2)两组分化得到的神经干细胞继续诱导,加入神经元培养基培养,14d左右均出现大量细长形、梭形、小圆形带突起细胞,MAP2染色阳性,如图4;加入胶质细胞培养基培养,10d左右可见大量胞体大、胞浆丰富呈多角形、星形的胶质细胞,GFAP染色阳性,如图5。

31RT2PCR结果

经RT2PCR检测,得到hESCs和神经干细胞的特异性标志物OCT4和nestin,如图6a所示。神经干细胞继续分化,检测到神经元或神经胶质的标志物MAP2或GFAP,如图6b所示。

41流式细胞仪鉴定分化细胞特征

经流式鉴定,取各组3次实验结果的平均值,两组细胞Nestin阳性细胞率分别为6817%(A组)和7615%(B组)。

讨　　论hESCs定向诱导分化为神经细胞的研究报道较多,方法不一。早期研究认为,从胚胎干细胞得到神经分化,必须要模仿胚胎产生神经外胚层的环

境,通过拟胚体形成来提供细胞2细胞间的相互作用和信号[5],故而经EB法[1]是最早应用的经典分化方法,但是该方法周期长,容易污染而影响正常的诱导过程;诱导产生的神经细胞成熟度不一,纯度低,无法满足进一步移植治疗的需要。随后研究发现,胚胎干细胞与基质细胞共培养[2],可以得到纯度较高的神经前体细胞,但是这一过程的具体机制尚不清楚,分化的神经细胞会受到基质细胞不明成分的污染,不利于研究分化过程中的信号通路等问题。Smukler等[6]将≤10个/μl鼠胚胎干细胞(低细胞密度抑制了细胞间的信号作用)置于无血清无饲养层无生长因子的培养基中,发现在4h之内,>90%的细胞表达Nestin,3d时大多数存活细胞保持神经前体细胞的特征,7d左右细胞死亡。表明在外界信号缺无时,胚胎干细胞可以迅速获得神经前体细胞的特征,这与胚胎干细胞直接分化为神经细胞的“预设机制”(defaultmechanism)相符。hESCs的相应研究也支持这种“预设机制”神经分化的概念[7,8]。相应的,用外源性因子增加这种预设机制产生的神经干细胞的生存能力、激活内源性cAMP通路或干扰凋亡,可以增加神经干细胞的生成。基于此理论,产生了直接诱导法[3]。该方法经过较短的周期就能得到较高比例的神经前

体细胞,细胞产物也没有受到外源成分的污染,为进一步应用于临床提供了可能。但是目前各研究中添加因子的种类较多,尚未形成一套完善的培养方法。

研究认为,在早期胚胎发育中,每个外胚层细胞都具有成为神经细胞的内在程序。在完整胚胎中,这个程序被广泛表达的骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)所抑制。Noggin可以阻止BMP与其在外胚层上的同源受体结合,拮抗BMP的作用,从而促进神经细胞的生成[9]。文献报道诱导过程中noggin浓度为5002700ng/ml,用量较大,价格昂贵。ITSFn组成成分为胰岛素、转铁蛋白、亚硒钠和纤维连接蛋白,均为细胞发育所必须的营养因子,本研究将noggin与ITSFn相结合,减少noggin用量(减少约1/2用量),通过直接诱导法,得到了纯度较高的神经干细胞(79111%±6119%),与EB法(6913%±3143%)相比较,差异有统计学意义(P<0101)。神经干细胞继续诱导,经免疫荧光和RT2PCR检测(如图426所示),得到了不同数量的神经元和胶质细胞。提示直接诱导法和经EB法都能够成功的使hESCs分化为神经细胞,但直接诱导法的具体作用机制以及最适宜的因子尚需进一步研究。此外,在直接诱导法的研究中,发现FGF和Wnt信号通路等也参与其中[6],但它们具体作用于改变初期神经细胞生成或是影响神经细胞后期增殖尚不清楚。

本研究中发现,经EB法诱导,hESCs细胞形成EB的数量有限,必须肉眼看到的较大克隆才能进一步形成成熟的EB,其余体积较小的克隆逐渐坏死,需要大量的hESCs克隆才能产生一定量的EB。并且EB培养时,对悬浮培养等条件要求较高,一旦EB贴壁,则会自行向三个胚层的细胞分化,严重影响hESCs的定向诱导。EB形成后,继续诱导时消化过程困难,本文采用了机械法加胰酶消化两种方法,先用机械法将EB分割为小块,再用胰酶消化,过程操作复杂,细胞暴露于外界时间较长,污染率高。而直接分化法,则相对操作简单,48h内即有散在的神经样细胞出现。该方法不仅缩短了诱导分化的时间(周期约30d),避免了EB生成量小及悬浮培养等问题,而且其神经分化效率明显高于经EB法,也降低了成本,是一种经济实用的诱导方法。

参　考　文　献

〔1〕ZhangSC,WernigM,DuncanID,etal1Invitrodiffer2

2　36　中国组织化学与细胞化学杂志第18卷

entiationoftransplantableneuralprecursorsfromhu2manembryonicstemcells1NatBiotechnol,2001,19:112921332

图　版　说　明

图1　相差显微镜下观察,hESCs呈巢式生长(×100)。图2　相差显微镜下观察,简单拟胚体,细胞团体积较大

(×100)。

〔2〕ZengXM,CaiJL,ChenJ,etal1Dopaminergicneurons

differentiationofhumanembryonicstemcells1Stemcells,2004,22:9252940

图3　免疫荧光法检测Nestin表达。a:B组48h得到的

nestin阳性细胞(×100);b:典型神经干细胞nestin

〔3〕ShinS,MitalipovaM,NoggleS,etal1Longtermpro2

liferationofhumanembryonicstemcell2derivedneuro2epithelialcellsusingdefinedadherentculturecondi2tions1StemCells,2006,24:1252l38

染色阳性(×100)。

图4　免疫荧光法检测MAP2表达,B组分化的神经元

MAP2阳性(×100)。

〔4〕ChenH,QianK,ZhangSM,etal1Thederivationof

twoadditionalhumanembryonicstemcelllinesfromday3embryoswithlowmorphologicalscores1HumanRepro,2005,20(8):2012206

图5　免疫荧光法检测GFAP表达,B组分化的神经胶质

GFAP阳性(×100)。

图6　RT2PCR法检测胚胎干细胞、神经干细胞、神经元

和神经胶质的不同标志物OCT4、nestin、MAP2和

GFAP,GAPDH作为内参考。〔5〕ChunyuCaiandLauraGrabel1Directingthedifferentia2

tionofembryonicstemcellstoneuralstemcells1DevDyna,2007,236:325523266

EXPLANATIONOFFIGURESFig11　Usingcontrastphasemicroscope,hESCsarelike

nest(×100)1

Fig12　Usingcontrastphasemicroscope,whenEBformed,

thecellsarelargerandtransparent1

Fig13　Expressionofnestindetectedbyimmunofluorescence1a:

NestinpositivecellsofgroupB48h(×100);b:Nes2tinflurescencestainofNSCs(×100)1

Fig14　MAP2positiveneuronsofgroupBdetectedbyim2

munofluorescence1(×100)1

Fig15　GFAPpositiveastrocytesofgroupBdetectedbyim2

munofluorescence1(×100)1

Fig16　ExpressionofOCT4,nestin,MAP2andGFAPde2

tectedbyRT2PCR1TheexpressionlevelsofeachgenearenormalizedtothatofGAPDH1

〔6〕SmuklerSR,RuncimanSB,XuS,etal1Embryonicstemcellsassumeaprimitiveneuralstemcellfateintheabsenceofextrinsicinfluences1CellBiol,2006,172:79290

〔7〕SchulzTC,NoggleSA,PalmariniGM,et

al1Differentiationofhumanembryonicstemcellstodo2paminergicneuronsin

serum2free

suspensioncul2

ture1StemCells,2004,22:121821238

〔8〕VallierL,ReynoldsD,PedersenRA1Nodalinhibits

differentiationofhumanembryonicstemcellsalongtheneuroectodermaldefaultpathway1DevBiol,2004,275:4032421

〔9〕Munoz2SanjuanI,BrivanlouAH1Neuralinduction,the

defaultmodelandembryonicstemcells1NatRevNeu2rosci,2002,3:2712280

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