细胞免疫荧光步骤

方法一：

首先需要把细胞养在玻璃片上〔悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片〕

1.

2. 然后在 4％ PFA里面室温下固定 30 分钟， PBS洗两次， 0.1%TX-100 室温下作用 1－ 2 分钟使细胞膜通透。 3.

接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器〔面积大，扁平状的，比方大的培养皿〕里面，放一张用水打湿的 滤纸，以保持湿度。

4.

剪一片适宜大小的 parafilm ，在上面滴上稀释在 1％ BSA/TBS中的一抗〔稀释倍数依具体抗体而定〕，每个玻 璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面〔细胞面朝下〕，室温下孵育

30 分钟，然后在 PBS里洗三次。

5. 接下来二抗孵育步骤同上。

6. 最后，在载玻片加上 mountingmedium 〔大约每个玻璃片加 10ul 〕，把玻璃片放上去〔细胞面朝下〕，

37度 30

分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做

WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.

双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次〔可以都试一下看看那种方法适宜〕。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，

我用的是来源于 rabbit 和 rat 〔绿〕和 donkeyanti-rat-Tex-Red

的抗体， 二抗那么是不同荧光信号标记的， 〔红〕。

我用的是 donkeyanti-rabbit-FITC

2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗

4 度孵

育过夜比拟好，背景比拟清晰。 3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，

阴性对照那么分别是家兔和大鼠的

10%的正常 donkey 血清。

IgG，荧光标记物对照是 PBS+荧光标记物。

4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是

其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

5.

方法三：

1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在

24well/12well/96well

中直接染色

2. 细胞爬片的制作：直接购置公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖

氨酸处理后让细胞自己爬片

3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。 4. 其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没问题的。 5. 固定：用 PBS洗去培养液，用固定液〔如甲醇和丙酮；

4%多聚甲醛；酒精。 。。〕固定细胞。

6. 内源性过氧化物酶处理， 3%过氧化氢处理细胞 〔选作，二抗连 HRP得必做， 其他的如做免疫荧光染色不用做〕 。 7. 通透〔胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做〕

，一般选用 Triton-X100 1-2 小时。

来做细胞通透，浓度

和时间需要摸索，一般是 0.1-5% ，处理时间为 1-30 分钟，级个别需要到

8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约

10%的浓度 inPBS 中封闭半小时，也可以选用

5-10%脱脂奶粉。封

闭结束后千万不要洗，直接上一抗。

细胞免疫荧光步骤

9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如

santacruze,Abcam,sigma.... 。选取具体的抗体，但是一

抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购置抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是

4 度过

夜或者 37 度 1 小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。

10. 洗去一抗。

11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动

物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是 37 度半小时。

12. 底物显色〔选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色

过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做〕

13. 洗去二抗，染核 14. DAPI 或者 Hoechst 染核

15. 洗去染核液，加 PBS，上镜观察。

方法四：

(1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接

近长成单层后取出盖玻片， PBS洗两次； 对悬浮生长细胞， 取对数生长细胞， 用 PBS离心洗涤 (1000rpm ，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

(2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。 固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的 PBS中 4℃ 保存 3 个月。 PBS 洗

涤 3× 5min。

(3) 通透。使用交联剂 ( 如多聚甲醛 ) 固定后的细胞，一般需要在参加抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗

体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在

5-15min 。通透后用 PBS洗

涤 3× 5min。

(4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。

(5) 一抗结合。室温孵育 1h 或者 4℃过夜。 PBST漂洗 3 次，每次冲洗 5min。

1h。PBST漂洗 3 次，每次冲洗 5min 后，再用蒸馏水漂

(6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育

洗一次。

(7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

方法五：

1． 漂洗血清蛋白 PH7.2-7.4 ， 37 度 PBS2小时 .

2． -20 度甲醇固定

20 分钟后，自然、枯燥 10 分钟

3． PBS洗净： 3min＊ 3

4． 1%Triton ： 25min-30min. 配成 50ultriton+5mlpBS

5． PBS洗净： 2＊5min

6． 羊血清封闭： 37 度， 20 分钟

7． 一抗， 4 度过夜，一般要大于 18 小时或者 37 度 1-2 小时

细胞免疫荧光步骤

8． 4 度 PBS洗净，３ min ＊5 次

9． 二抗

37 度小于一小时 37 度

PBS洗净， 3＊ 3min

10．

11．

凉干封片〔封闭液 〕

细胞免疫荧光步骤：

1. 细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲 静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约 爬片可以在培养皿六孔板或24

8 小时烤干备用。

孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费〔培养皿可以重复利用〕二来

?

觉得培养皿口大，操作比拟方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液〔注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子 的质量〕

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基〔以使玻片与培养皿紧密接触〕 细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于 时或更长时间适时取出爬片。

，将玻片小心放入摆放其中，然后将单

24 小

37 度 5％ CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，

爬片置于 37 度 PBS中洗三次，每次 3 到 5 秒钟，然后在 4％多聚甲醛中固定 15 分钟，然后再用 37 度去离子水

要不然真的是前功尽弃。

将甲醛冲干净， 注意手法轻柔， 要不然掉片很厉害。 同时操作过程中注意玻片的正反面， 将做好的爬片置于滤纸上晾干，

然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续

20 保存备用，具体能保存多长时

实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－ 间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定 10min( 固定细胞器用预冷的 70%甲醇 +30%丙酮 ) ； 3.PBS 漂洗 5min；

4.0.5%Triton 穿孔 15min( 丙酮固定法不用透化处理 ) ； 5.PBS 漂洗 2 次，每次 5min； 6.1%BSA封闭 30min；

7. 参加 1%BSA稀释的一抗，于 37℃ 杂交 2h；

细胞免疫荧光步骤

8.PBS 漂洗 2 次，每次 5min；

9. 参加 1%BSA稀释的二抗，于 37℃ 杂交 1h； 10.PBS 漂洗 2 次，每次 5min；

染色 2min ；

12. 抗淬灭封片剂封片。 抗淬灭封片剂 : 2.5%DABCO(w/v)

50mMTris(pH8.0) 90%甘油

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光

细胞爬片

4%多聚甲醛固定 10min

( 固定细胞器用预冷的 70%甲醇 +30%丙酮 )

PBS漂洗 5min

0.5%Triton

穿孔 15min

( 丙酮固定法不用透化处理 ) PBS漂洗 2 次，每次 5min

1%BSA封闭 30min

参加 1%BSA稀释的一抗，于 37℃杂交 2h

PBS漂洗 2 次，每次 5min

参加 1%BSA稀释的二抗，于 37℃杂交 1h

PBS漂洗 2 次，每次 5min

5ug/mlDAPI 染色 2min 抗淬灭封片剂封片

2.5%DABCO(w/v)

抗淬灭封片剂 50mMTris(pH8.0)

90%甘油

9ml 甘油

0.5ml1MTris(Ph8.0)70 ℃ 溶解， - 20℃ 保存

2

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