细胞免疫荧光步骤

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起首须要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞须要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）

然后在4％PFA里面室温下固定30分钟,PBS洗两次,0.1% TX-100室温下感化1－2分钟使细胞膜通透.

接下来进行荧光标识表记标帜,须要在一个大的容器（面积大,扁平状的,比方大的造就皿）里面,放一张用水打湿的滤纸,以保持湿度.

剪一片适合大小的parafilm,在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定）,每个玻璃片30ul足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下）,室温下孵育30分钟,然后在PBS里洗三次.

接下来二抗孵育步调同上.

最后,在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细胞面朝下）,37度30分钟,然后就可以在荧鲜明微镜下不雅察了.

抗体很主要,不克不及有非特异性联合.你可以先做WB检测一下你的抗体,看看有没有杂带.

双标的话,可以把两个一抗一路加或者分离标识表记标帜两次（可以都试一下看看那种办法适合）.假如一个抗体须要二抗,一个是直接荧光标识表记标帜的,可以把荧光标识表记标帜的谁人和别的一个的二抗一路加.

办法二：

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拔取一抗时要起源于两种不合的动物,我用的是起源于rabbit和rat的抗体,二抗则是不合荧光旌旗灯号标识表记标帜 的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）.

我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度.孵育时光要细心探索,我感到一抗4度孵育过 夜比较好,布景比较清楚.

我的阳性对比用的是阳性组织切片,阴性对比则分离是家兔和大鼠的IgG,荧光标识表记标帜物对比是PBS+荧光标识表记标帜物.

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关闭血清与二抗起源动物一致,我用的是10%的正常donkey血清. 其余步调统一般免疫荧光单标操纵.

办法三：

1. 片子的制造：

可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在

24well/12well/96well中直接染色

2. 细胞爬片的制造：直接购置公司的已经处理过的细胞爬片,如果本身制造的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞本身爬片

3. 细胞甩片：须要甩片机将细胞悬液平均甩到玻片上. 4. 其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的.

5. 固定：用PBS洗去造就液,用固定液（如甲醇和丙酮;4%多聚甲醛;酒精...）固定细胞.

6. 内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞（选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不必做）.

7. 通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白须要做;细胞膜蛋白不须要做）,一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时光须要探索,一般是0.1-5%,处理时光为1-30分钟,级个体须要到1-2小时.

8. 关闭：洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中关闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉.关闭停止后万万不要洗,直接上一抗.

9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma.....拔取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要探索,抗体稀释液可以购置抗体公司现成的,对于新手照样挺好的.时光一般是4渡留宿或者37度1小时.一抗最好照样选用外国抗体公司的抗体. 10. 洗去一抗.

11. 上二抗,二抗一般抗体公司会给你推举的,你在个中选上一个就行了,本身选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗谁人动物的就行了.二抗的浓度也是须要探索的,抗体稀释液和一抗雷同就行了.二抗的时光一般是37度半小时.

12. 底物显色（选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的解释书添加就行了,显色时光可能须要探索,以免显色过度引起假阳性;二抗连得是荧光陈述的不必做）

13. 洗去二抗,染核 14. DAPI

或者Hoechst染核

15. 洗去染核液,加PBS,上镜不雅察. 办法四：

细胞预备.对单层发展细胞,在传代造就时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的造就皿中,待细胞接近长成单层后掏出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮发展细胞,取对数发展细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片.

(2) 固定.依据须要选择恰当的固定剂固定细胞.固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保管3个月.PBS洗涤3×5 min.

(3) 通透.应用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般须要在参加抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以包管抗体可以或许到达抗原部位.选择通透剂应充分斟酌抗原蛋白的性质.通透的时光一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

(4) 关闭.应用关闭液对细胞进行关闭,时光一般为30min.

(5) 一抗联合.室温孵育1h或者4℃留宿.PBST漂洗3次,每次冲洗5min.

(6) 二抗联合.间接免疫荧光须要应用二抗.室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次.

(7) 封片及检测.滴加封片剂一滴,封片,荧鲜明微镜检讨.

(1)

办法五：

1． 漂洗血清蛋白

P,37度 PBS 2小时.

2． -20度甲醇固定20分钟后,天然.湿润 10分钟 3． PBS洗净：3min＊3

4． 1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5． PBS洗净：2＊5min

6． 羊血清关闭：37度,20分钟

7． 一抗,4渡留宿,一般要大于18小时或者37度1-2小时 8． 4度PBS洗净,３min＊5次 9． 二抗 37度小于一小时 10．37度 PBS洗净,3＊3min

11．凉干封片（关闭液）

细胞免疫荧光步调：

1.细胞爬片;起首是玻片的处理,通俗的盖玻片用砂轮划成本身要的大小的小方块,先用洗衣粉洗清洁,用水冲静烤干,然后泡酸留宿,捞酸后流水洗净,烤干,置于器皿中高压灭菌,然后再烤箱中大约8小时烤干备用.

爬片可以在造就皿 六孔板或24孔板中都可,我选择在造就皿中爬.一为勤俭经费（造就皿可以反复应用）二来认为造就皿口大,操纵比较便利.造就皿消毒同上,消毒时记得消两把镊子

具体操纵是：用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成单细胞悬液（留意：这一点很主要,关系到未来爬出来片子的质量）

掏出消毒的造就皿,可以先加少量造就基（以使玻片与造就皿慎密接触）,将玻片当心放入摆放个中,然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上.最后盖上造就皿置于37度5％CO2的暖箱中造就,依据细胞发展状态,24小时或更长时光合时掏出爬片.

爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4％多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲清洁,留意手段轻柔,要不然失落片很厉害.同时操纵进程中留意玻片的正不和,要不然真的是前功尽弃.

将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上.留意必定要等中性树胶完整干了之后才干做后续试验,要不然玻片会失落下来的,就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保

管备用,具体能保管多长时光不太清楚,当然尽量早用.

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮); 3.PBS漂洗5min;

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不必透化处理); 5.PBS漂洗2次,每次5min; 6.1%BSA关闭30min;

7.参加1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h; 8.PBS漂洗2次,每次5min;

9.参加1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h; 10.PBS漂洗2次,每次5min; 11.5ug/ml DAPI染色2min; 12.抗淬灭封片剂封片. 抗淬灭封片剂: 2.5% DABCO (w/v) 50mM Tris(pH8.0) 90%甘油

细胞免疫荧光 细胞爬片

4%多聚甲醛固定10min

(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)

PBS漂洗5min 0.5% Triton 穿孔15min (丙酮固定法不必透化处理) PBS漂洗2次,每次5min

1%BSA关闭30min

参加1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h

PBS漂洗2次,每次5min

参加1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h

PBS漂洗2次,每次5min 5ug/ml DAPI染色2min 抗淬灭封片剂封片

2.5% DABCO (w/v) 抗淬灭封片剂 50mM Tris(pH8.0) 90%甘油 0.25g DABCO 9ml甘油

0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃消融,-20℃保管 0.5ml ddH2O