流式 蛋白方法总结

流式与westen在检测蛋白表达方面各有什么优缺点？流式可以检测在胞浆中表达的蛋白吗？敏感性怎么样？操作上有什么特殊要求？

流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白。流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。

流式检测时要求有抗体，可以是直接标记或间接标记的荧光抗体。细胞需要预先固定处理，常用的是多聚甲醛、TritoonX－100、75％乙醇等，具体步骤可参考相关文献，都有详细说明。

荧光抗体标记的选择指南： 对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物质标记的抗体。厂家根据需要开发了各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测，各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系，看能否检测。在附表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一下：

1、流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接发，即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影响检测结果。

2、厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、western等，首选前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非常理想。

3、单抗和多抗均可应用。

4、绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法得出了满意的结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不能一起检测。

5、如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。我自己比较倾向于多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。

请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照？

首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对照。如：你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原， 荧光染料为FITC， 抗体来源为大鼠的IgG1亚型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1）， 你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC， 一般的抗体说明上都会写清。

、流式同型对照怎样选择？

同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。

同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａPE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。

很多朋友知道样品处理时有个阴性对照，用来区别加药和不加药或者其他样本的状态．但是对于流式上的同型对照，却不是很了解！

一、为什么要用同型对照？

同 型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型 对照是

真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。

在流式细胞仪上样前，染色方式如下：样本管：一抗＋样本，同型对照管：同型对照＋样本

二、如何选择同型对照？

(1)一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56 FITC标记的抗体，成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是FITC标记的MouseIgG1,κ。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.

(2)如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CD86的纯化抗体，成分是MouseIgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,。那么染色方式如下：样本管：纯化的CD86＋PE标记的抗Mouse IgG1(二抗)＋样本,同型对照管：纯化的同型对照＋PE标记的抗MouseIgG1(二抗 )＋样本.

(3)如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类别。比如，某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。

3、哪些客户需要使用同型对照？

A 对流式不是非常熟悉的客户。

B 做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。

C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。

D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户，一般可以不使用同型对照。

4、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？

首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

1、同型对照不是万能的。同型对照虽然与试验抗体是同种型，而且具有相同的荧光标记，但不一定是同一厂家生产的，肯定不是同一批次的，也很难保证每个抗体上标记的荧光分子的数目是相同的，所以很多情况下发现用同型对照调的参数并不合适。

2、是否需要同型对照取决于要检测的指标。

（1）对于一些细胞特异性的亚群标志，比如CD3/4/8这些，对于某一细胞来说它或

者表达，或者不表达，这时只要抗体和标记技术没问题都会清晰分群，无需同型对照，甚至不需要阴性对照。

（2）某些分子在细胞上原本不表达，或表达极低，加入处理因素后表达明显上调，这种通常也能明显分群，也不需要同型对照，但要有未加处理因素的阴性对照。检测细胞表面活化分子的表达，细胞内因子检测等通常是这种情况。

（3）如果细胞群中大部分细胞都表达要检测的目标分子，只是有的表达高些，有的表达低些，通常细胞不能明显分群。此时通常需要以同型对照做参考，虽然它也不一定百分之百正确。

流式检测胞内抗原时打孔液的配方？

打孔液有很多种，方法也有很多。与你的实验方法相关。我用过酒精固定或Triton X-100（我做的都是培养的细胞）：

（1）70%的酒精固定24小时即可，不再需要再打孔。如在PI染色测细胞周期或凋亡。

（2）Triton X-100是比较强烈的穿孔剂。0.1% Triton X-100/PBS（再加0.1%BSA） 是比较温和一点。浓度可适当提高。作用时间以几分钟为宜。这个时间必须要自己试。时间长了细胞易破裂，短了则打孔不够。如果你要染胞浆，则时间适当短些，如果要染内质网或核内等，由于要对两层膜性结构打孔，时间当然会长一些。为了使得荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合，在加染料前就应该用0.1%triton x-100处理细胞5-10min

（3）可以试试0.1% saponin（皂素）saponin - --皂素 (sigma公司的)

我们用的是0.1%的浓度,放在4度保存,能用1-2个月

配制的方法

saponin------------1gPBS----------------100ml

小牛血清--------10-15ml

对于淋巴细胞,透膜的最佳时间是冰浴15min ,长了或者短了都不好

请问下表中流式细胞仪给出的平均值是什么意思，是怎样得到的，有些文献中提到“fluorescence per cell\"，是下面的mean值吗，还是要用mean值除以第1栏的细胞数events，才能得到fluorescence per cell ？

mean 值就是每个细胞的平均荧光强度，不用再除细胞数。这只是个相对值，如果求绝对值，应用已知荧光剂浓度值对应仪器给出的mean值，做标准曲线。以后你得到的mean值，就可以根据这条标准曲线查出真正的荧光浓度值。

另外以流式细胞术怎样测定进行所需检测物质的定量研究？

进行检测物质的定量最简单的方法就是统计检测蛋白的平均荧光强度。常用的流式检测统计方法：一个是阳性率，另外一个就是平均荧光强度，平均荧光强度是一种观测蛋白表达相对定量的简单常用方法。细胞表面表达的蛋白越多，其结合的荧光标记抗体越多，因此其平均荧光强度就越高。进行这种方法检测要求每次流式检测的机器条件要完全一致，

并且整个试验过程不能拖得太长，因为随着时间的推移，即使前后使用的仪器条件完全一致，但是机器本身的效能也会改变。我曾经观察过，仪器经过半年时间其效能就要发生明显得改变，需要进行光路的调整。因此，最好整个试验过程不要超过半年，否则前后的可比性就较差了。

如果你检测的是胞内分泌性蛋白（如细胞因子），应在细胞培养过程中加入莫能霉素，以阻断细胞因子的分泌；收获细胞后以4％多聚甲醛固定20min，加入0.1Triton X-100破膜10min，以后步骤与检测膜表面分子相同。也可采用皂素进行破膜。

关于流式细胞检测后的统计学处理 常常有人在检测完细胞后问我如何进行结果的问题。

常见的检测结果如有明确的分组和例数，例如有人检测患者在治疗前后淋巴细胞免疫分类的变化，如果各检测了50例，可以按照常规的统计学方法，如采用配对T检验进行统计处理。

常常见到的是另外一种情形，如有人检测一种药物或者转基因后对细胞周期的影响，或者某种物质对细胞一种蛋白表达的影响。像这一类实验，常常仅仅有实验细胞和对照细胞，在得出结果后，有人喜欢进行统计学处理，还有人不进行统计学处理，仅给出典型的流式检测图进行描述。两者都可以，但是要求是必需重复实验三次以上，否则，不可能进行统计学处理。对于后者，尽管不进行统计学处理。但是必需说明，重复多少次，结果基本一致。

HO-1活性测定：

根据HO-1降解血红素生成胆红素和CO原理，以样品反应物中胆红素生成量代表HO-1活性。血清20μl中加入2mmol/L正铁血红素［血晶素（hemin），美国Sigma公司提供］40μl、4.5mmol/L还原型辅酶Ⅱ（NADPH，德国Boehyinger Mannheim公司提供，Na4-NADPH，纯度>98%）40μl，同一只健康豚鼠的肝组织匀浆上清液20μl（作为胆绿素还原酶的来源）、0.1mol/L 的KH2PO4缓冲液（pH 7.4）1.8ml，避光置37℃、10min，将反应物棕色小瓶置于冰上终止反应。不含NADPH的样品作空白对照，样品与空白均做双份，在分光光度计上用4nm和530nm双波长测定胆红素生成量（胆红素摩尔吸光系数：0.025nm/cm），以每小时每升血清生成胆红素量［nmol/（h*L）］为单位。

实验设计流程

配制固定剂、破膜剂

方案一：70%冰乙醇过夜

离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！一般选择4℃固定过夜；

方案二：

固定剂：

甲醛固定：用0.01%甲醛（PBS配制）固定10-15分钟（稳定蛋白）

破膜剂：

0.1% saponin（皂素）

我们用的是0.1%的浓度,放在4度保存,能用1-2个月

配制的方法

saponin------------1g

PBS----------------100ml

小牛血清--------10-15ml

对于淋巴细胞,透膜的最佳时间是冰浴15min ,长了或者短了都不好

1、 细胞固定破膜

胰酶消化细胞之后，终止消化，离心，PBS洗涤，离心收集细胞，

加用0.01%甲醛（PBS配制）固定10-15分钟（稳定蛋白），离心，去上清，

加0.1% saponin（皂素）冰浴穿透5-15分钟接下来离心收集细胞

2、 抗体染色

染一抗