胶原蛋白的分离纯化及氨基酸组成分析

维普资讯 http://www.cqvip.com 鳓镑舞簿　磬　｜＿　＿　ｌ　■工艺技】Ｉｃ　胶原蛋白的分离纯化及氨基酸　组成分析　李燕　，王川　，蓝蔚青　（１．上海水产大学食品学院，上海２０００９０；　２．上海市食品研究所，上海２００２３５）　摘要：以新鲜猪皮为原料，用酶法提取胶原蛋白。对提取物用超滤、盐析等方法进行分离纯化，超　滤方法较合适。通过电泳方法确定胃酶提取物中胶原蛋白的分子量分布范围在８－１０ｋｕ，胰酶提取物　中胶原蛋白的分子量分布范围在３－５ｋｕ。氨基酸分析表明胶原蛋白中Ｈｙｐ含量达８．５％。　关键词：胶原蛋白；羟脯氨酸；分离；纯化；氨基酸组成　中图分类号：Ｔｓ　文献标志码：Ａ　文章编号：１００５—９９８９（２００７）１０—０１３７—０４　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｒＯｍ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｋｉｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ＬＩ　Ｙａｎ　，ＷＡＮＧ　Ｃｈｕａｎ２，ＬＡＮ　Ｗｅｉ－ｑｉｎｇ　收稿日期：２００７—０４—２６　作者简介：李燕（１９６５一），女，硕士，副教授，研究方向为生物活性物质的提取和应用。　６％、水解温度３４℃、ｐＨ值为３、水解时间为７ｈ。　３结论　［２】Ｇｕａｎ－Ｈｏｎｇ　Ｅｌ，Ｇｕｏ－Ｗｅｉ　ＩＢ　Ｙｏｎｇ－Ｈｕｉ　Ｓｈｉ，ｅｔ　ａＬ　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　Ｉ—ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｆｏｏｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，２４：４６９—４８６　胃蛋白酶水解河蚌肉可以得到具有较高ＡＣＥ抑　制率的水解物。　采用胃蛋白酶水解河蚌肉，水解产物的ＡＣＥ抑　［３】　Ｆｅｒｒｅｉｒａ　Ｓ　Ｈ＿Ａ　ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ—ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｖｅｎｏｍ　ｏｆ　Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｊａｒａｒａｃａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａ—　ｃｏｌｏｇｙ，１９６５，２４：１６３—１６９　制率与Ｅ：Ｓ、温度、ｐＨ值、时间的回归方程为Ｙ：　８３．４３４２９—５．６Ｘ２＋１、２Ｘ３＋１．６Ｘ４—３．９０８５７１Ｘ１。＋３．６Ｘ１Ｘ４—　［４】曹文红，章超桦、食品蛋白降血压肽及其酶法制备（一）、食　品科技，２００２，（４）：９—１０　９．００８５７１Ｘ￣一１．８Ｘ２Ｘ３—１１．７Ｘ２Ｘ４—９．９０８５７１Ｘ３２－２．４ｘ３）（４—　３．６０８５７１Ｘ４２。　［５】　曹文红，章超桦．食品蛋白降血压肽及其酶法制备（二）．食　品科技，２００２，（５）：１　１－１３　［６】Ｃｕｓｈｍａｎ　Ｄ　Ｗ，Ｃｈｅｕｎｇ　Ｈ　Ｓ、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９７１，２０：１６３７—１６４８　利用回归模型预测河蚌肉水解物的ＡＣＥ抑制率　与Ｅ：Ｓ、温度、ｐＨ值、时间的相关性是可行的。　胃蛋白酶的最优水解条件为Ｅ：Ｓ　６％，水解体系　温度３４℃，ｐＨ值为３，水解时间为７ｈ。　参考文献：　［７】Ｓｉｇｍａ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｔｅｓｔ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ—Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ（ＥＣ　３．４、１５、１）、Ｓａｉｎｔ　Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ：ｓｉｇｍａ，１９９８　『１】胡子毫，钟立人．食源性血管紧张素转换酶抑制，￣（ＡＣＥＩＰ）　的研究进展．食品安全监督与法制建设国际研讨会暨第　二届中国食品研究生论坛论文集（上），２００５：５３４—５３９　『８１郝记明．酶法水解马氏珠母贝肉制备血管紧张素转换酶　抑制肽的研究［Ｄ】．北京：中国农业大学，２００５　互　维普资讯 http://www.cqvip.com

≯》舞蕊　工艺技市■　ｊ赫　。　０　“　镳瓤　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００９０；　２．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３５）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｋｉｎ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ－ｄｉｇｅｓｔ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｍａｌｔｉｎｇ　ｏｕｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｆｉｔ．Ｐｏｌｙａｃｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｓ　ｗｅｒｅ　８￣１　０ｋｕ，３￣５ｋｕ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｐｅｐｓｉｎ　ａｎｄ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｙｐ　ｗａｓ　８．５％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　胶原蛋白又名胶原质，是由动物细胞合成的一　种生物性高分子，是构成动物结缔组织的主要蛋白　质，广泛存在于骨、腱、软骨、皮肤等结缔组织中，　在脊椎动物中约占总蛋白的ｌ／３。最常见的３种胶原　是Ｉ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原，其中Ｉ型胶原是成年动物　皮中的主要胶原形式。胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨　酸的含量是各种蛋白质中含量最高的Ｉｌｊ　蛋白质是一切生命体必不可少的组成部分，胶原　作为一大类蛋白质．在生物体内起着重要作用。由于　胶原蛋白有诸多优良性质，使这类生物高分子化合物　用途非常广泛，遍及医药、化工、食品等领域　。胶原　蛋白具有巨大的开发潜力和利用价值。　随着科学技术的发展．人们对胶原的应用越来越广　泛，对胶原蛋白的需求越来越大，如何既经济又快速获　得胶原蛋白已成为人们关注的课题。本文对胶原蛋白分　离纯化方法进行研究，并确定其中氨基酸的组成和含量。　１材料与方法　１．１实验原料　选用经检疫合格的生猪，屠宰后生剥皮，水温　控制在４０℃以下，然后去除表皮层和毛发。在试验　之前，把猪皮清洗干净，去除残留脂肪组织，切成小　颗粒或细条状，一１８￣Ｃ冻藏备用，实验时４￣Ｃ解冻。　１．２仪器设备　Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＧ１０—２．４Ａ冷冻离心机：Ｕｎｉｃｏ　ＵＶ一　２１０２紫外分光光度计；ＡＬＰＨ　ＡＬ一２冻干机：ＤＹＹ一　Ⅲ电泳仪：北京六一仪器厂；自动定氮仪：　ＫＴＪＥＬＴＥＣ，Ａｕｔｏｌ０３０　Ａｎａｌｙｚｅｒ：８３５—５０型氨基酸分　析仪：日立：ＷＲ一２００１溶剂过滤器：上海嘉鹏科技　有限公司。　１－３试剂材料　胃蛋白酶、胰酶：苏州东吴医用生化制药厂，　三氯乙酸，对二甲氨基苯甲醛，氯氨Ｔ，高氯酸，巯　基乙醇，柠檬酸缓冲液等。所有试剂均为分析纯；　超滤膜：ＴＳ一１００，ＣＸＡ一５０，上海医药工业研究院。　砸　丽　１．４实验方法　１．４．１　酶法提取胶原蛋白本实验选用胰酶、胃蛋白　酶进行酶解，提取猪皮中的胶原蛋白。去脂去杂蛋　白的猪皮，按原料：缓冲液（ｐＨ８～９）１：３匀浆，加入胰　酶搅拌均匀，在４５℃酶解４ｈ，沸水浴灭酶ｌＯｍｉｎ，　５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液，将上清液冷冻干　燥保存。去脂去杂蛋白的猪皮，按原料：缓冲液（ｐＨ２）　ｌ：７匀浆，加入胃蛋白酶搅拌均匀．在３７℃酶解６ｈ，　沸水浴灭酶ｌＯｍｉｎ，７０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清　液，将上清液冷冻干燥保存。　１．４．２蛋白质的测定用自动凯氏定氮仪测定。　１．４－３提取物的分离　１．４．３．１超滤超滤（简称ｕｒ）是以压力为推动力，利　用超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程［３１。　实验选用了分子量截留值为ｌ０万和５万的超滤膜　取一定量的用胰酶提取的胶原蛋白冻干粉溶解　于ｐＨ　８－９的缓冲液中，放入超滤器中，先后用分子　量截留值为ｌ０万和５万的超滤膜超滤。得到３个组　分的样品：被分子量截留值为ｌ０万的超滤膜截留的　胰酶提取物，被分子量截留值为ｌ０万的超滤膜滤过　同时被截留值为５万的超滤膜截留的胰酶提取物，被　截留值为５万的超滤膜滤过的胰酶提取物。　取一定量的用胃酶提取的胶原蛋白冻干粉溶解　于ｐＨ２的缓冲液中，放入超滤器中，用分子量截留　值为ｌ０万的超滤膜超滤。得到２个组分的样品：被　截流和滤过的胃蛋白酶提取物。　１．４．３．２盐析工艺流程见图１。　１．４．３－３提取物的透析将分离后的３个胰酶提取物和　２个胃蛋白酶提取物分别装入透析袋中，放入装有蒸　馏水的容器中进行透析，将透析后的产物冷冻干燥。　１．４．４电泳实验对冻干的胶原蛋白样品进行ＳＤＳ—　ＰＡＧＥ聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳。分离胶浓度为　ｌ５％（或１２％），浓缩胶浓度为３％。　ｌ。４。５氨基酸分析将样品在６ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｔ溶液中　于１　１０℃条件下水解１８ｈ，通过氨基酸分析仪测定其　维普资讯 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嘲谚　蓐　ｌ　ｌ粗提物　液　用４．４ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣＩ／０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７　搅拌过夜，离　ｌ￣＇（１４０００ｒ／ｍｉｎ×３０ｍｉｎ×４　淀　上清液　用２．４ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１／０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７　抽提２～３次，搅拌１～２ｈ后离心，再　离　Ｉ￣＇（１４０００ｄｍｉｎ×３０ｍｉｎ×４Ｔ：）　图１盐析工艺流程　氨基酸组成和含量。　２结果与讨论　２．１酶法提取胶原蛋白　胶原蛋白是由三股螺旋组成的，分子量在３０万１一１．　每条肽链的分子量大约为１０万１＝　∥　１。因胶原蛋白酶对　胶原蛋白的水解主要破坏胶原的螺旋区，使胶原蛋　白水解为小分子肽类及游离氨基酸，而其他蛋白酶　对胶原蛋白的酶解促溶，只是切除胶原蛋白的尾肽．　使其变为可溶［４１，所以用胃蛋白酶促溶的胶原蛋白溶　液，同原胶原具有相同的形状、大小及氨基酸组成，一一　一爹　一　　同酸溶性胶原蛋白在性质上无显著不同［５１，胃蛋白酶　水解胶原蛋白是在３７℃，胶原蛋白没有变性同，从图　１第４泳道的谱带可确定所提出的胶原蛋白为天然的、　未变性的大分子胶原蛋白。　胃蛋白酶提出的胶原蛋白粗品分子量在７．８￣１０　～　９．９ｘ１０４ｕ范围内，如图１所示，说明样品的结构保持　了肽链的完整性。然而，当胃蛋白酶提取物被截留值　为１０万的超滤膜分离之后，样品却被分解，形成了　小分子量片段，反而破坏了胃蛋白酶提取的胶原蛋白　的结构。从被分离的两组分样品的分子量测定结果可　以看出胃蛋白酶提取物无法被超滤膜完全分离　这　可能因为胃蛋白酶提取物的冻干粉溶解于ｐＨ２的缓　冲液中，形成了十分黏稠的液体，无法穿透超滤膜，　不利于超滤：并且胃蛋白酶提取的胶原蛋白粗品从　电泳图谱来看分子量相差不大，因此，用胃蛋白酶　提取的胶原蛋白不需再进一步分离。　根据电泳结果，胰酶提取得到的胶原蛋白样品　分子量分布在３．２ｘ１０４－５．１ｘｌ０　１１之间，说明胰酶的水　解力较强，已经把胶原蛋白水解为小分子片段。分　别用截留值为１０万和５万的超滤膜进行分离，不同　工艺技市　２　４　≮　＃。　３、．０ｋｕ—　嘲懒　２０．１ｋｕ———’　１４．４ｋｕ—　ｉ　１．标准蛋白；２．被截留值为１Ｏ万的超滤膜截流的胶原蛋白提取物　（组分１）；３．被截留值为１Ｏ万的超滤膜滤过的胶原蛋白提取物（组分　２）：４．胃酶水解后提取物。　图１　胃蛋白酶提取胶原蛋白的电泳图谱　组分收集到的产物用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳测得的分子量　结果相近，都在２～３万１１之间。　２．２酶法提取胶原蛋白的得率　脚；表１　酶解提取胶原蛋白的含量（凯氏定氨法）　３　从表１可看出．用胰酶提取胶原蛋白的样品中　蛋白质含量高于用胃蛋白酶提取的样品中蛋白质的　∞　含量，说明用胰酶提取的样品中蛋白质的得率较高，　６　１　２　但胰酶提取的胶原蛋白色泽偏黄，而胃蛋白酶提取　的胶原蛋白为纯净的白色。　６　２．３氨基酸组成分析　表２胶原蛋白中氨基酸组成及含量　胶原蛋白供酶提　胶原蛋白ｆ胃酶提　５　取怆量　ａａ仝数　ｇｚ）ｆ－￣，％ａａ个数　互　兰　卫　圳叭　犍　２昌８犍　跎　２　维普资讯 http://www.cqvip.com 工艺技市■　用酶法提取出的胶原蛋白其氨基酸组成和含量　与Ｓｉｇｍａ胶原蛋白标准品比较，结果如表２所示。　对表２的数据进行分析可以看出，在用胰酶和　胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中，甘氨酸的含量分别　为１９．７６％和１６．４１％，而ｓｉｇｍａ胶原蛋白标准品中甘　氨酸的含量是１　１．１４％。胶原蛋白Ｉ是由两条　１（Ｉ）和一　条　２组合而成的三股螺旋．一级结构表明，　肽链　的９６％都是按三联体的重复顺序（Ｇｌｙ—ｘ—ｙ）ｎ排列而成　的，Ｇｌｙ数目占残基总数的１／３［·１。表２的数据显示，胰　酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中每１００个氨基酸　中Ｇｌｙ的残基数分别为２９．６３和２４．７３个，而Ｓｉｇｍａ　胶原蛋白标准品中甘氨酸的残基数为２６．１０个。　Ｓｉｇｍａ胶原蛋白标准品中氨基酸的总量仅占６０．０３％，　其余为一些盐类杂质，这从ＳＤＳ—ＰＡＧＥ的电泳图谱　中也得到了验证，但在它的蛋白组成中，胶原蛋白　的含量占９５％，达到了较高的纯度。本实验用胰酶　和胃蛋白酶提取　的胶原蛋白中，蛋白含量分别为　９８．７２％和９８．８９％．蛋白含量都高于ｓｉｇｍａ胶原蛋白　标准品，但纯度略低，分别为８１％和８４％。若经过　适当的纯化处理，可提高其纯度。如本实验中用胰　酶提取的胶原蛋白用截留值为５万的超滤膜分离，　在滤过组分的蛋白中胶原蛋白的含量达８７％。　２．４盐析　盐析的原理是在蛋白质溶液中加入大量的中性　盐．使蛋白质沉淀析出。取一定量的用胃酶提取的　胶原蛋白冻干粉经过盐析、透析，最后冷冻干燥后　得到０．０８２１ｇ冻干粉，盐析物的得率是０．２４％。盐析　物的电泳图谱见图２。从谱带的迁移率可以看出，盐　析后获得的胶原蛋白的分子量在１０万Ｕ，但经过盐　析的整个过程，最终获得的产品极少。　９７．４ｋｕ——－＋　嘲　醣　６６．２ｋｕ——　镤　擎　１标准蛋ｒ＿１；２．盐析后的胃蛋白酶提取物。　图２盐析后胶原蛋白电泳图谱　２．５胶原蛋白的微生物、理化指标检测　通过一系列提取Ｔ艺条件及纯化方法的探索，确　．日目　囹　＝委　定用胃蛋白酶和胰酶从猪皮中提取胶原蛋白。所得样　品各项指标如下：色泽与形状：白色絮状（胃蛋白酶提　取），淡黄色粉末（胰酶提取）；ｐＨ值（水溶液）７．３７；铅　０．４６ｍｇ／ｋｇ；砷＜０．１ｍｇ／ｋｇ；细菌总数９ｃｆｕ／ｍＬ；大肠菌　群＜３ＭＰＮ／１００ｍＬ；致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄　色葡萄球菌、溶血性链球菌）：未检出（注：检测样品为　胶原蛋白的水溶液（１０ｍｇ样品／２５０ｍＬ水）：氨基酸分　析（冻干粉）：胶原蛋白中羟脯氨酸占总氨基酸　８．５％　３结论　电泳实验结果表明，胰酶的水解能力较强，把　胶原蛋白分解成分子量为３～５ｋｕ的小分子片段；而　胃蛋白酶提取的胶原蛋白的分子量在８～１０ｋｕ．保持　了肽链的完整性。　羟脯氨酸测定结果表明，胰酶提取的胶原蛋白　的含量与胃蛋白酶提取的胶原蛋白的含量相当，但氮　的测定结果显示胰酶提取物中蛋白质的含量明显高　于胃蛋白酶提取物中蛋白质的含量。但冻干后的胶原　蛋白样品色泽偏黄．胃蛋白酶提取的胶原蛋白冻干后　的样品色泽洁白。　电泳实验和羟脯氨酸测定结果表明．胃蛋白酶　提取的胶原蛋白不需要进一步的分离；而胰酶提取的　胶原蛋白只需用截留值为５万的超滤膜进行分离。　在本实验中．不适用葡聚糖凝胶分离酶解提取　物。选择使用超滤膜来分离提取物（超滤膜可能会使　长链的胶原蛋白断裂）。　胰酶和胃蛋白酶提取的胶原蛋白在分子量和得　率、纯度等方面存在差异。因此根据需要决定选用何　种酶来提取胶原蛋白。　参考文献：　【１］王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学ＩＭ］．北京：高等教育出版　社．２００２：２１５—２１８　【二　Ｐ　Ｋｉｔｔｉｐｈａｔｔａｎａｂａｗｏｎ，　Ｓ　Ｂｅｎｊａｋｕｌ，　Ｗ　Ｖｉｓｅｓｓａｎｇｕａｎ，　ｅｔ　ａ１．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｉｄ－ｓｏｌｕｂｌｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｒｏｍ　ｓｋｉｎ　ａｎｄ　ｂｏｎｅ　ｏｆ　ｂｉｇｅｙｅ　ｓｎａｐｐｅｒ（Ｐｒｉａｃａｎｔｈｕｓ　ｔａｙｅｎｕｓ）［］ｊ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２００５，　８９：３６３—３７２　【３］　苏拔贤．生物化学制备技术【Ｍ］．北京：科学出版社，１９８６：　１８９－２１８　【４】永井裕，藤本大三郎．胶原蛋白试验方法【Ｍ】．上海：上海中　医学院出版社．１９８８　『５］　ＪＭｏｒａｌｅａ　ＰＭｏｎｔｅｍ　Ａｍｏｒａｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃ—　ｔｅｆｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｍｕｓｃｌｅｃｏｌ１ａｇｅｎｉｎｓｏｍｅ　ｃｅｐｈａｌｏ－　ｐｏｄｓ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２０００，４８：２１４２－２１４８　【６】李开雄，赵志远，刘霞．猪皮中胶原蛋白的提取及其应用　叭肉类研究，ｌ９９６，（４）：４３－４８