(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105555856 A (43)申请公布日 2016.05.04
(21)申请号 201480036795.X(22)申请日 2014.04.25(30)优先权数据
61/816,686 2013.04.26 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.12.25
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/CA2014/000380 2014.04.25(87)PCT国际申请的公布数据
WO2014/172786 EN 2014.10.30(71)申请人奇迹连结生物技术公司
地址加拿大安大略省(72)发明人安东·科列涅夫斯基
埃尔兹塞贝特·帕普-绍博约翰·罗伯特·达彻奥列格·斯图卡洛夫(74)专利代理机构北京康信知识产权代理有限
责任公司 11240
代理人张英 宫传芝
权利要求书2页 说明书14页 附图2页
(51)Int.Cl.
C08L 5/00(2006.01)A61K 47/36(2006.01)A61K 9/00(2006.01)A61K 9/14(2006.01)C08J 3/12(2006.01)C08J 5/18(2006.01)C12N 5/04(2006.01)C12P 19/00(2006.01)
(54)发明名称
植物糖原纳米颗粒及其制造方法(57)摘要
提供了一种纯化自含植物糖原的植物材料的植物糖原纳米颗粒的组合物。植物糖原纳米颗粒的组合物是单分散性的。提供了一种从含植物糖原的植物材料分离组合物的方法，其包括微滤和超滤的步骤，但是避免了使用降解植物糖原材料的化学处理、酶处理或热处理。 C N 1 0 5 5 5 5 8 5 6 ACN 105555856 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种组合物，包含获自含有植物糖原的植物材料的植物糖原纳米颗粒，通过动态光散射(DLS)测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指数。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，通过DLS测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于0.2的多分散指数。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，通过DLS测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于0.1的多分散指数。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述植物糖原纳米颗粒具有约30nm和约150nm之间的平均颗粒直径。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述植物糖原纳米颗粒具有约60nm和110nm之间的平均颗粒直径。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于80％的具有约30nm和50nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于90％的具有约30nm和150nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于99％的具有约30nm和150nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于80％的具有约60nm和110nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于90％的具有约60nm和110nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于99％的具有约60nm和110nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料是获自玉米、水稻、大麦、高粱或它们的组合。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型(su)或含糖增量剂(se)型甜玉米。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料获自乳熟期或凹陷期玉米粒。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是粉末。16.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是所述植物糖原纳米颗粒的含水分散体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物作为成膜剂的用途。18.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物作为药物递送剂的用途。19.一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括：
a.将破碎的含有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50℃之间的温度的水中；b.使步骤(a.)的产物经受固液分离以获得含水提取物；c.使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15μm之间的最大平均孔径的微滤材料；和
d.使来自步骤c.的滤出液经受超滤以除去具有低于约300kDa的分子量的杂质，从而获
2
CN 105555856 A
权 利 要 求 书
2/2页
得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是谷物。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述谷物是玉米、水稻、大麦、高粱或它们的混合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型(su)或含糖增量剂(se)型甜玉米。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型(su)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期籽粒。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，包括步骤(e.)使所述包含单分散性植物糖原纳米颗粒的所述含水组合物经受使用淀粉蔗糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任何组合的酶处理。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，进一步包括在步骤c或步骤d之前添加吸附性过滤助剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述吸附性过滤助剂是硅藻土。27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中，所述固液分离包括将步骤(a.)的产物搅拌10至30分钟的时间段。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中，步骤(d.)的超滤除去具有小于约500kDa分子量的杂质。
29.根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中，步骤c.包括使步骤(b.)的所述含水提取物穿过(c.1)具有约10μm和约40μm之间的最大平均孔径的第一微滤材料；(c.2)具有约0.5μm和约2.0μm之间的最大平均孔径的第二微滤材料；和(c.3)具有约0.05μm和约0.15μm之间的最大平均孔径的第三微滤材料。
30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，进一步包括离心步骤b.的产物。31.根据权利要求19至30中任一项所述的方法，进一步包括(e.1)干燥包含单分散性植物糖原纳米颗粒的所述含水组合物，以获得基本上单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组合物。
32.一种组合物，包含根据权利要求19至31中任一项所述的方法生产的基本上单分散性纳米颗粒。
33.根据权利要求16所述的组合物，其是根据权利要求19至30中任一项的方法生产的。34.根据权利要求15所述的组合物，其是根据权利要求31的方法生产的。
3
CN 105555856 A
说 明 书
植物糖原纳米颗粒及其制造方法
1/14页
相关申请的引证
[0002]本申请要求2013年4月26日提交的美国专利申请61/816686的优先权，并且其内容由此以其整体并入。
技术领域
[0003]本发明涉及植物糖原(phytoglycogen)纳米颗粒以及生产植物糖原纳米颗粒的方法。
背景技术
[0004]植物糖原和糖原是由1,4-葡聚糖链组成的葡萄糖多糖，其通过α-1,6-葡萄糖苷键高度支化，其在植物动物细胞中发挥储能介质的作用。糖原以直径为20-200nm的致密颗粒的形式存在于动物组织中。糖原也发现积累在微生物中，例如细菌和酵母菌。植物糖原是一种在结构和物理性质上与糖原相似的多糖，并且起源于植物。[0005]糖原和植物糖原被认为是“高度分散的”或非均质材料。对于已知的制剂，糖原典型地具有处于106和108道尔顿之间的分子量，具有相应的大的多分散性。动物和植物组织以及提取的糖原/植物糖原制剂的透射电子显微镜(TEM)观察已经揭示了这些多糖的微粒性质。常报道的糖原或植物糖原的颗粒直径处于20-300nm的范围内并且具有连续或多峰(multimodal)尺寸分布。20-30nm的小颗粒被称为β-颗粒，而100-300nm的大颗粒被称为α-颗粒。认为，α-颗粒是由β-颗粒聚集(aggregation)或群聚(clustering)组成的[1]。[0006]已经开发了各种方法从活有机体中分离糖原和植物糖原，最常见的是为了量化生物样品中积累的总糖原的量，并且偶尔为了将糖原在应用中用作产品。[0007]最常用的方法是从动物组织、特别是从海洋动物、尤其是软体动物提取，因为它们有能力积聚糖原。例如，美国专利5,734,045公开了通过使用热碱提取、随后使用阳离子树脂中和并处理所产生的溶液从蚌类制备不含蛋白质的糖原的方法。例如，在专利申请WO/1997/021828所描述的，糖原也可以通过酵母菌发酵来生产。美国专利7,670,812描述了一种通过使酶的混合物与低分子量糊精接触生物合成生产糖原样多糖的方法。甜玉米和香稻可作为糖原的来源；参见例如专利申请EP0860448B1，其描述了从香稻粒分离糖原的方法。[0008]糖原/植物糖原分离的主要步骤通常包括：通过粉碎/研磨/碾磨等破碎生物质；将糖原提取到水相中；通过过滤和/或离心分离不溶性固体颗粒；消除微细分散或溶解的脂质、蛋白质和低分子量污染物；和浓缩并干燥。[0009]为了提高第二提取步骤中糖原的收率，通常在提高的温度下和/或使用碱性溶液或酸性溶液进行提取。此种工艺包括使用热的浓(20-40％)碱溶液[2,3]、冷酸[4]或沸水[5]对研细的生物材料进行初始处理。
[0010]在糖原分离/纯化的常规方法中使用的工序导致糖原结构的大量水解、低分子量产物的显著增加和分子的化学改变。
[0011]已经开发了各种较温和的提取工序，诸如冷水提取[6]，并且得到的产物据称接近
4
[0001]
CN 105555856 A
说 明 书
2/14页
天然状态的糖原的表现度。但是，已知由冷水提取法生产的糖原制剂是高度多分散的[7,1]。
[0012]已知有多种方法用于进行从精细分散的蛋白质、脂质、核酸和其他多糖中纯化粗制糖原提取物的步骤。可以通过使用脱氧胆酸盐(DOC)、三氯乙酸(TCA)、多价阳离子和/或酶处理(蛋白酶、核酸酶)的选择性沉淀来除去蛋白质和核酸。还已经使用通过将蛋白质盐析出来(例如使用硫酸铵)或通过离子交换以去除蛋白质的方法。蛋白质去除的另一种常用方法是热凝固，通常在65-100℃，随后离心或过滤。高压灭菌法(121℃，1atm)也已经被用来凝固蛋植物糖原提取物中的蛋白质[8]。另外，可以使用酚水提取法除去蛋白质和脂质。[0013]国际专利申请公开号WO 2013/019977(Yao)教导了一种获得包括植物糖原的提取物的方法，其包括超滤，但是也使水性提取物经受酶处理，这同时降解了植物糖原及其他多糖。Yao提取了一种降低植物糖原粘度的方法，其通过使植物糖原经受β-淀粉分解，即使用β-淀粉酶进行酶促水解。通过Yao的方法产出的“经纯化的植物糖原”不仅包括植物糖原，而且包括植物原的衍生物，衍生物包括β-糊精和其他多糖的消化产物。Yao的方法进一步包括将提取物加热至100℃(参见Yao的实施例1)。
[0014]美国专利5,895,686公开了一种用于通过水或含水溶液(在室温下)从水稻提取植物糖原的方法，并且通过热变性和TCA沉淀除去蛋白质。产物具有多峰分子量分布，相应地
这些性质可归因于来自植物材料的糖原制剂中大量支链具有高多分散性和大水溶液粘度。
淀粉和直链淀粉的存在，还归因于糖原提取过程中糖原的降解。
[0015]美国专利5,597,913和5,734,045描述了产生基本不含含氮化合物和还原糖的糖原的工序，指示了其不含蛋白质和核酸的纯度。这些专利教导了选定组织在高pH溶液中沸腾的使用。
[0016]转让给本发明的拥有人的美国专利申请公开号US20100272639 A1提供了一种用于从细菌和贝类生物质中分离糖原的方法。细菌被教导为是优选的，因为可以进行方法以获得不具有其他大分子量多糖(诸如支链淀粉和直链淀粉)并且不含与贝类或动物组织有关的致病细菌、寄生虫、病毒和朊病毒的生物质。所公开的方法大体包括步骤：通过法式按压(French pressing)或通过化学处理进行细胞瓦解(disintegration)；通过离心分离不溶性细胞组分；通过酶处理、随后渗析从细胞裂解物中除去蛋白质和核酸，其产生含有粗制多糖和脂多糖(LPS)的提取物或，可替代地，酚-水提取；通过弱酸水解或通过多价阳离子的盐的处理(其引起不溶性LPS产物的沉淀)消除LPS；和通过超滤和/或尺寸排阻色谱法纯化富集了糖原的级分；和使用适合的有机溶剂沉淀糖原或可以通过超滤或超速离心法获得浓缩的糖原溶液；和冷冻干燥以产生糖原的粉末。从细菌生物质分离出的糖原的特点是MWt 5.3-12.7x 106Da，具有直径为35-40nm的颗粒尺寸并且是单分散性的(PDI＝Mn/Mw＝1.007-1.03)。
发明内容
[0017]在一个实施方式中，描述了一种从含有植物糖原的植物材料中获得植物糖原纳米颗粒的组合物，通过动态光散射(DLS)测定，该植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指数。在一个实施方式中，通过DLS测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.2的多分散指数。在一个实施方式中，通过DLS测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.1的多分散指数。
5
CN 105555856 A[0018]
说 明 书
3/14页
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约30nm至约150nm之间的平均颗粒直
径。在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约60nm至110nm之间的平均颗粒直径。[0019]在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于80％的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于90％的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于99％的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于80％的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至110nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于90％的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至110nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于99％的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至110nm之间的平均颗粒直径。
[0020]在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自玉米、水稻、大麦、高粱或它们的组合。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是标准型(su)或含糖增量剂(surgary extender，se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自乳熟期或凹陷期玉米粒。
[0021]在一个实施方式中，组合物是粉末。在另一个实施方式中，组合物是植物糖原纳米颗粒的含水分散体。
[0022]本文还描述了一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括：a.将破碎的含有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50℃之间的水中；b.使步骤(a.)的产物经受固液分离以获得含水提取物；c.使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15μm之间的最大平均孔径的微滤材料；和d.使来自步骤c.的滤出液经受超滤以除去具有低于约300kDa的分子量的杂质，从而获得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。[0023]在方法的一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是谷物。在一个实施方式中，谷物是玉米、水稻、大麦、高粱或它们的混合物。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是标准型(su)或含糖增量剂(se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是标准型(su)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期籽粒。[0024]在一个实施方式中，方法包括步骤(e.)使包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物经受使用淀粉蔗糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任何组合的酶处理。[0025]在一个实施方式中，方法包括步骤(e.1)干燥包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物，以获得基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组合物。[0026]在一个实施方式中，方法包括在步骤c或步骤d之前添加吸附性过滤助剂。在一个实施方式中，吸附性过滤助剂是硅藻土。[0027]在一个实施方式中，固液分离步骤包括将步骤(a.)的产物搅拌10至30分钟的时间段。
[0028]在方法的一个实施方式中，步骤(d.)的超滤除去分子量低于500kDa的杂质。[0029]在一个实施方式中，步骤c.包括使步骤(b.)的含水提取物通过以下(c.1)、(c.2)和(c.3)：(c.1)具有约10μm至约40μm之间的最大平均孔径的第一微滤材料；(c.2)具有约0.5μm至约2.0μm之间的最大平均孔径的第二微滤材料；和(c.3)具有约0.05至0.15μm之间
6
CN 105555856 A
说 明 书
4/14页
的最大平均孔径的第三微滤材料。[0030]在一个实施方式中，方法进一步包含将步骤b.的产物离心。
[0031]本文中还描述了根据所描述的方法产生的基本上是单分散性的纳米颗粒的组合物。
[0032]在一个实施方式中，本文所描述的组合物被用作成膜剂。在一个实施方式中，本文所描述的组合物被用作药物递送剂。
附图说明
[0033]图1是植物糖原纳米颗粒的示意图。
[0034]图2示出了使用DLS测量的根据实施例1分离的植物糖原的颗粒尺寸分度。[0035]图3示出了使用DLS测量的根据实施例2分离的植物糖原的颗粒尺寸分布。
[0036]图4示出了对于根据本发明一个实施方式的单分散性植物糖原纳米颗粒的水分散体的粘度对浓度(w/w％)。
具体实施方式
[0037]本文中使用的“植物抗原”是指从植物材料获得的α-D葡萄糖链的纳米颗粒，该α-D葡萄糖链具有11至12的平均链长、具有1→4键并且在1→6处发生支化点并且具有约6％至约13％的支化度。
[0038]在一个实施方式中，提供了一种高分子量葡萄糖均聚物的单分散性纳米颗粒的组合物。在一个实施方式中，提供了一种单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。[0039]通过动态光散射(DLS)技术确定的多分散指数(PDI)，被定义为标准偏差与平均直径的比率的平方：PDI＝(σ/d)2。另外，可以通过聚合物的分子量分布来表示PDI，并且定义为Mw与Mn的比率，其中Mw是重量平均摩尔质量并且Mn为数量平均摩尔质量(这种PDI量度在下文中被称为PDI*)。在第一种情况下，单分散性材料具有接近0的PDI(0.0)并且在第二种情况下－1.0。在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的组合物，通过DLS测量，该植物糖原纳米颗粒具有小于约0.3、小于约0.2、小于约0.15、小于约0.10、小于0.07或小于0.05的PDI。在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的组合物，通过SEC MALS测量，该植物糖原纳米颗粒具有小于约1.3、小于约1.2、小于约1.15、小于约1.10或小于1.05的PDI*。
[0040]由于许多原因，单分散性是有利的，包括如果组合物的纳米颗粒是单分散性的，那么表面改性和衍生的发生更具可预测性。尺寸也影响纳米颗粒在生物组织中的分布和累积以及药代动力学。另外，窄尺寸分布对于诸如诊断探针、催化剂、纳米薄膜和受控流变等应用是至关重要的。
[0041]可以通过本领域众所周知的方法来测评纳米颗粒尺寸，包括直径的分布(分散性)
例如TEM和原子力显微镜。和平均值。这些方法主要包括DLS和显微技术，
[0042]在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的单分散性组合物，该植物糖原纳米颗粒具有约30至约150nm之间的平均颗粒直径，在一个实施方式中为约60nm至约110nm之间。与在现有组合物中看到的聚集的α-颗粒相反，这些纳米颗粒是单个颗粒。[0043]在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒产自谷物。在一个实施方式中，植物糖原产
7
CN 105555856 A
说 明 书
5/14页
自玉米、水稻、大麦、高粱或它们的混合物。
[0044]所使用的品种必须是含有植物糖原的。可以容易地由本领域技术人员使用公知技术进行确定品种是否含有植物糖原。此外，对于许多品种，公开的文献确定了品种是否含有植物糖原。
[0045]在一个实施方式中，组合物获自甜玉米(玉米(Zea mays)变种saccharata和玉米(Zea mays)变种rugosa)。在一个实施方式中，甜玉米是标准型(su)或含糖增强(se)型。[0046]在一个实施方式中，组合物获自甜玉米的凹陷期或乳熟期籽粒。[0047]在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒的单分散性组合物基本上是纯的。在一个实施方式中，组合物基于干重由至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％的具有约30nm至约150nm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在另一个实施方式中，组合物基于干重由至少约99％的具有约30nm至约150nm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在一个实施方式中，组合物基于干重由至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％的具有约60nm至约110nm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在另一个实施方式中，组合物基于干重由至少约99％的具有约60nm至约110nm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。
[0048]在一个实施方式中，组合物基本上不含其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有少于约10％的其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有少于约5％的其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有少于约1％的其他多糖。[0049]糖原
[0050]糖原和植物糖原由通过α-1→4-葡萄糖苷键连接的葡萄糖残基的直链组成，其中侧链通过α-1→6-葡萄糖苷键附接。来自不同来源的哺乳动物糖原的化学分析显示其平均链长度为～13个残基[9]。如图1所示，糖原结构的接受的模型具有内链和外链，内链通常含有两个支化点，外链是未支化的。整个树形聚合物根植于蛋白质糖原蛋白(G)的单分子。[0051]糖原分子的密度随着层的数目呈指数增加。经计算，向糖原分子添加的第13层不能增加糖原残基的密度，使得12层为理论最大[9]。一个重要的特征是，以这种方式完全形成的任何分子的最外层会含有该分子的总葡萄糖残基的～45-50％作为未支化的A-链，而首先的八个内层仅含有总葡萄糖的～5％。因此，这种模型中的全尺寸糖原分子会由12层组成，总共～53000个葡萄糖残基，分子质量为～107kDa且直径为～25nm。虽然主要由葡萄糖残基组成，糖原可以含有其他痕量组分，尤其是葡糖胺和磷酸酯[1]。数学建模显示，糖原分子的结构性质取决于三个参数，即，支化度(r)、层数(t)和每个链中的葡萄糖残基的数目(gc)[9、10、11、12、13]。
[0052]虽然由生长机理显示了糖原分子为球形，但是当分子生长超出一定的限制时，其会失去结构的同质性，因为支化度和链长度在最终层中退化(degenerate)。[0053]植物糖原
[0054]尽管糖原和植物糖原具有非常类似的结构，但是在这些多糖的功能目的上存在主要差异。糖原在动物和细菌中旨在用作短期“燃料”储备以优化快速周转。[0055]在植物中，主要能量来源是淀粉，其存储在树叶、茎、种子、根等中。与糖原相反，淀粉是一种长期的能源策略，其允许植物在恶劣的气候环境中生存。淀粉包含两种类型的多聚葡糖：支链淀粉(其是高度支化的)和直链淀粉(其几乎是直链的，几乎没有分支)。在来自
8
CN 105555856 A
说 明 书
6/14页
不同来源的淀粉中，两种组分的含量存在较大的变化，但是通常认为，支链淀粉是储存淀粉中的主要组分并且占据约65-85重量％。
[0056]支链淀粉具有由串联式集群(各自长度为约9-10nm)组成的确定结构，其中直链α-1,4-葡聚糖链是通过α-1,6-葡萄糖苷键高度规律支化的。由支链淀粉支链形成的半结晶结构是生物和经济重要的，因为这种结构允许植物高密度地储存碳(～1.6g cm-3)[14]。[0057]支链淀粉是由四类酶的多个同种型合成的：可溶性淀粉合成酶(SS)、淀粉支化酶(BE)、ADP葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉脱支酶(DBE)。存在相同的4类涉及糖原合成的酶。[0058]这解释了支链淀粉和糖原结构之间的类似性：均为α-1,6-支化的α-1,4-聚葡糖。然而，支链淀粉中的平均链长(gc)为20-25，约为糖原的两倍，而支化度(r)低约1.5-2倍。[0059]异淀粉酶(ISA)中的突变以及由此的脱支化活性的缺陷，导致支链淀粉被植物糖原的部分替代。在植物中积累的此种植物糖原的最常见实例是玉米、水稻和其他谷物的含糖1(su)突变体。
[0060]植物糖原在结构上类似于糖原，具有11-12的平均链长度和类似的支化度，并且典型地具有106-108Da的分子量。但是，所报道的比糖原更大的颗粒尺寸暗示着更低的支化度和/或更低的结构均一性。鉴于糖原是高度优化的代谢产物，而植物糖原是支链淀粉合成中排列紊乱的结果，所以植物糖原的较低结构均一性是不可预期的。[0061]本发明人们已经实验确定，所报道的植物糖原组合物的多分散性事实上部分地由破坏性分离方法所致，并且所观察到的多分散性可进一步起因于精细分散的污染物诸如蛋白质、脂质和其他多糖的存在。使用本文所描述的方法，本发明人们已经产生了植物糖原的单分散性组合物。
[0062]生产单分散性植物糖原的方法[0063]如上所讨论的，糖原/植物糖原分离的主要步骤典型地包括：1.通过粉碎/研磨/碾磨等破碎生物质；2.将糖原提取到水相中；3.通过过滤和/或离心分离不溶性固体颗粒(固体)；4.消除微细分散或溶解的脂质、蛋白质和低分子量污染物；和5.浓缩并干燥。一些操作可以被合并，例如碾磨和提取。[0064]在一个实施方式中，一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法包括：[0065]a.在约0和约50℃之间的温度下，将破碎的植物材料浸泡在水中；在一个实施方式中，在约4℃和约20℃之间的温度下；
[0066]b.使步骤(a.)的产物经受固液分离以获得含水提取物；[0067]c.适合地在多级过滤过程中过滤步骤(b.)的含水提取物，但是至少穿过具有约0.1μm的最大平均孔径的微滤材料；
[0068]d.使来自步骤c.的滤出液经受超滤以除去分子量低于约300kDa(在一个实施方式中，低于约400kDa；在一个实施方式中，低于约500kDa)的杂质，以获得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。
[0069]在一个实施方式中，方法进一步包括离心步骤b的产物。
[0070]然后可以干燥含水组合物以得到基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。[0071]在一个实施方式中，植物材料是谷物。在一个实施方式中，植物材料是玉米、水稻、大麦、高粱或它们的混合物。在一个实施方式中，植物材料是甜玉米(玉米变种saccharata和玉米变种rugosa)的籽粒。在一个实施方式中，使用甜玉米的乳熟期或凹陷期的成熟籽
9
CN 105555856 A
说 明 书
7/14页
粒。
[0072]
在各个实施方式中，植物糖原的收率为植物材料干重的约5％和50％之间、约10％
和约50％之间、约20％和50％之间、约30％和约50％之间、约40％和约50％之间、约10％和约40％之间、约20％和40％之间、约30％和约40％之间。植物糖原的准确产率将取决于所使用的植物材料，包括品种和成熟期。以玉米为例，对于乳熟期籽粒成熟期，发明人们已经获得在籽粒干重的35-40％的范围内的收率，而对于凹陷成熟期获得了20-30％的收率。考虑到先前报道的植物糖原的高多分散性，单分散性植物糖原的这些收率是出乎预料的。[0073]制备破碎植物材料的方法对于本领域技术人员是众所周知的。生物质破碎的方法包括研磨、碾磨或粉碎生物材料。植物材料被适合地破碎成小于约0.5mm的平均颗粒尺寸。[0074]在一个实施方式中，通过适度搅拌10-30分钟进行冷水提取。在一个实施方式中，冷水提取是在约0℃和约50℃之间的温度下进行的。在一个实施方式中，在约4℃和约20℃之间的温度下进行冷水提取。搅拌的最佳周期、温度和搅拌速率取决于破碎的生物质的性质，并且对它们的确定处于本领域技术人员的技能范围内。
[0075]将由冷水提取产生的含水提取物离心以分离出粗制非可溶性固体。适合地，可选地在约3,000至约6,000x g下离心提取物。适合地，通过在约6,000至约12,000x g下进行进一步离心，这从粗制植物糖原提取物中部分地分离出精细分散的蛋白质和脂质。[0076]离心之后是过滤上清液。如本文所描述的，进行多级过滤和超滤，已经惊人地发现这除去了大部分的蛋白质、脂质和污染性多糖(包括直链淀粉和支链淀粉)，而不需要任何的化学处理、酶处理或热处理，由此产生单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。适合地在使用0.1μm最终介质孔径的阶段中进行微滤。在一个实施方式中，微滤依次使用如下介质孔径进行：a)在一个实施方式中，约5μm和约50μm之间，在一个实施方式中，约10μm和约40μm之间，在一个实施方式中，约15μm和约35μm之间,在一个实施方式中，约20μm和约30μm之间，并且在一个实施方式中，约25μm；b)在一个实施方式中，约0.5μm和约2.0μm之间，在一个实施方式中，约1.0μm；和c)在一个实施方式中，约0.05μm和约0.15μm之间，在一个实施方式中，0.1μm。在一个实施方式中，在离心之前，可以向植物抗原提取物中加入吸附性过滤助剂诸如硅藻土。在一个实施方式中，以约2-10％wt/体积的量使用吸附性过滤助剂，在一个实施方式中，约3-5％wt/体积之间。
[0077]使来自微滤的最终滤出液经受超滤，其从中去除低分子量污染物包括盐、蛋白质和糖(例如糊精、葡萄糖、蔗糖或麦芽糖)。超滤可以使用具有约300至约500kDa的分子量截止(MWCO)的交叉流过滤(CFF)来进行。
[0078]微滤和超滤的各种方法均为本领域技术人员众所周知并且可以采用任何适合的方法。
[0079]可选地，在超滤之后，可以使含有植物糖原的含水分散体经受酶处理以降低多分散性。适合地，其可以使用淀粉蔗糖酶、糖原合成酶、糖基转移酶和支化酶或它们的任何组合进行处理。但是，应当避免消化支链淀粉和直链淀粉(例如，β-淀粉酶)的酶，因为它们会产生各种降解的聚葡糖的溶液，而非植物糖原纳米颗粒的纯化组合物。[0080]可以通过CFF超滤工艺浓缩植物糖原分散体(最高达30％)。可替代地，在CFF超滤之后，可以使用适合的有机溶剂诸如丙酮、甲醇、丙醇等(优选乙醇)沉淀植物糖原。方法进一步包括适合地通过喷雾干燥或冷冻干燥来干燥植物糖原提取物。各种标准浓缩和/或干
10
CN 105555856 A
说 明 书
8/14页
燥方法诸如使用降膜蒸发器、升膜蒸发器、喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥或它们的组合等来脱水植物糖原分散体和/或收集固体形式的植物糖原产物。[0081]如实施例中示出的，取决于所使用的起始植物材料，所得到的植物糖原的材料的特征在于30nm和150nm之间的颗粒直径，连同通过DLS测量的低至0.07的多分散指数。[0082]确保高纯度材料及其单分散性的关键在于精细微滤和超滤的组合。[0083]纳米颗粒的化学官能化
[0084]本发明的实施方式包括具有化学官能化表面的纳米颗粒和分子和/或与各种各样的分子结合的纳米颗粒。化学官能化在合成领域中是众所周知的。参见例如March,Advanced Organic Chemistry,第六版,Wiley,2007。官能化可以在颗粒的表面进行或同时在颗粒的表面和内部进行，但是将糖原分子的结构维持为如上的单支化均聚物。[0085]此类官能化的表面基团包括但不限于亲核基团与亲电基团、酸性基团和碱性基团，包括例如羰基、胺基、硫醇基、羧基或其他酸性基团。氨基可以是伯、仲、叔或季氨基。可以使用不饱和基团诸如乙烯基和烯丙基官能化本文所描述的纳米颗粒。[0086]所分离和纯化的纳米颗粒可以被直接或间接官能化，在间接官能化中可以使用一个或多个中间接头或间隔子。纳米颗粒可以经受一个或多于一个官能化步骤，包括两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个官能化步骤。
[0087]官能化的纳米颗粒可以进一步与各种的分子结合，分子在各种应用中是感兴趣的，诸如生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、螯合剂、分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂，以及这些化合物的各种组合。
[0088]可以使用用于多糖官能化或衍生化的已知方法。例如，一种方法是通过选择性氧化C-2、C-3、C-4和/或C-6位的葡萄糖羟基来导入羰基。存在有广泛的可使用的氧化剂，诸如高碘酸盐(例如高碘酸钾)、溴、二甲基亚砜/乙酸酐(DMSO/Ac2O)[例如，美国专利号4,683,298]、戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)等。
[0089]本文所描述的纳米颗粒在用羰基官能化时可容易地与携带有伯胺基或仲胺基的化合物反应。这导致形成亚胺，其可以使用还原剂例如硼氢化钠被进一步还原为胺。因此，还原步骤提供比亚胺中间体更稳定的氨基产物，并且还将未反应的羰基转化为羟基。羰基的消除显著地降低了衍生的纳米颗粒与非靶分子(例如血浆蛋白)的非特异性相互作用的可能性。
[0090]可以在一个容器中同时进行羰基化合物和氨基化合物之间的反应以及还原步骤(向相同反应混合物中导入适合的还原剂)。这种反应被称为直接还原胺化反应。此处，可以使用在羰基的存在下选择性还原亚胺的任何还原剂，例如氰基硼氢化钠。[0091]为了从羰基官能化的纳米颗粒制备氨基官能化的纳米颗粒，可以使用任何铵盐或含伯胺或仲胺的化合物，例如乙酸铵、氯化铵、肼、乙二胺或己二胺。这种反应可以在水中或在含水极性有机溶剂例如乙醇、DMSO或二甲基甲酰胺中进行。
[0092]还可以通过使用下列两步法来实现本文所描述的纳米颗粒的还原胺化。该第一步是烯丙基化，即通过在还原剂例如硼氢化钠的存在下与烯丙基卤反应将羟基转化为烯丙基。在第二步骤中，使烯丙基与双官能氨基硫醇化合物例如氨基乙硫醇反应。[0093]可以进一步修饰氨基官能化的纳米颗粒。例如，氨基与羰基化合物(醛和酮)、羧酸
11
CN 105555856 A
说 明 书
9/14页
及其衍生物(例如酰氯、酯)、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、磺酰氯化物等反应。[0094]在某些实施方式中，使用氰基化过程将本文的纳米颗粒官能化。这种过程导致在多糖羟基上形成氰酸酯和亚氨基碳酸酯。这些基团在非常温和的条件下可以与伯胺容易地反应，形成共价键。氰化剂诸如溴化氰并且优选1-氰基-4-二乙基氨基-吡啶盐(CDAP)可以被用于纳米颗粒的官能化。
[0095]官能化的纳米颗粒可以被直接附接至携带有能够结合羰基或氨基的官能团的化合物。但是，对于一些应用，通过间隔子或接头(包括例如聚合物间隔子或接头)来附接化合物可能是重要的。这些可以是携带有官能团(包括但不限于氨基、羰基、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和异氰酸酯)的同双官能接头或异双官能接头，例如二氨基己烷、糖双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸)乙二酯(磺基-EGS)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸酯(磺基-DST)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、氨基乙硫醇等。[0096]用于纳米颗粒/结合的化合物和改性剂[0097]在某些实施方式中，可以被用来修饰本文所描述的纳米颗粒的化合物包括但不限于：生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、螯合剂、分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂、以及这些化合物的各种组合。
[0098]在某些实施方式中，作为用于修饰本文所描述的纳米颗粒的化合物的生物分子包括但不限于酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞应答的化合物(诸如生长因子和趋化
核酶、反义剂和核酸。因子)、抗体、疫苗、半抗原、毒素、干扰素、
[0099]在某些实施方式中，本文所描述的纳米颗粒的小分子改性剂可以是可用作催化剂的那些，并且包括但不限于金属有机络合物。[0100]在某些实施方式中，作为纳米颗粒的改性剂的药用部分包括但不限于疏水性改性剂、药代动力学改性剂、生物活性改性剂和可检测的改性剂。[0101]在某些实施方式中，可以使用具有光吸收、光发射、荧光、发光、拉曼散射、荧光共振能量转移和电致发光特性的化合物来修饰纳米颗粒。[0102]在某些实施方式中，纳米颗粒的诊断标签包括但不限于用于γ闪烁和正电子发射断层扫描(PET)的诊断放射性药物或放射性同位素，用于磁共振成像(MRI)的造影剂(例如顺磁性原子和超顺磁性纳米晶体)，计算机断层扫描用造影剂，X射线成像用造影剂，超声诊断方法用造影剂，中子活化剂，以及以各种光学程序中可以反射、散射或影响X光、超声波、无线电波和微波、荧光的其他部分等。诊断用放射性药物包括γ-发射放射性核素，例如铟-111、锝-99m、碘-131等。MRI(磁共振成像)用造影剂包括磁性化合物，例如顺磁性离子、铁、锰、钆、镧系元素、有机顺磁性部分和超顺磁性、铁磁性和反铁磁性化合物，例如氧化铁胶体、铁素体胶体等。计算机断层扫描及其他X射线基成像方法用造影剂包括吸收X射线的化合物，例如碘、钡等。基于超声的方法用造影剂包括吸收、反射和散射超声波的化合物，例如乳液、晶体、气泡等。其他实例包括用于中子活化的物质，诸如硼和钆。进一步的，可以采用的标签能够反射、折射、散射或以其他方式影响X射线、超声波、无线电波、微波和在诊断程序中有用的其他射线。在某些实施方式中，改性剂包括顺磁性离子或基团。[0103]在某些实施方式中，可以使用两种或更多种不同的化合物来生产多官能衍生物。例如，第一化合物选自潜在特异性结合生物分子的列表，诸如抗休和核酸适体，并且第二化
12
CN 105555856 A
说 明 书
10/14页
合物选自潜在诊断标签的列表。[0104]在某些实施方式中，使用本领域一般公知的方法(参见，例如，Nanobiotechnology II,Eds Mirkin and Niemeyer,Wiley-VCH,2007.)，本文所描述的纳米颗粒可以被用作制造无机纳米材料的模板。这可以包括用带电荷的官能团官能化纳米颗粒，随后矿化，这可包括在各种阳离子例如金属、半导体的溶液中温育官能化的纳米颗粒。然后可以将本文所描述的矿化的纳米颗粒纯化并且用于各种应用中，应用包括但不限于医学诊断、传感器、光学、电子等。[0105]组合物
[0106]在一个实施方式中，纳米颗粒组合物为如在超滤步骤后获得的含水提取物的形式。
[0107]在一个实施方式中，纳米颗粒组合物是干燥的并且该组合物是粉末。[0108]本发明的干燥纳米颗粒组合物容易地可溶于/可分散于水、甘油中以及一些有机溶剂诸如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺DMF中。在一个实施方式中，组合物包含分散于水或溶剂中的干燥纳米颗粒。与先前的糖原组合物相比，单分散性纳米颗粒组合物具有独特的流变性质。本发明的纳米颗粒组合物的含水分散体在最高达按重量计25％的浓度下未显示出显著的粘度。与此相比，Yao(WO 2013/019977)的“纯植物糖原”在15.2w/w下显示出3.645pas的粘度(3645±315mPas)。[0109]在一个实施方式中，组合物的在室温下的为从制造日期起保持至少24个月货架稳定。
[0110]工业适用性
[0111]本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物可以被用在广泛的食品、个人护理、工业和医学应用中。例如，组合物可以被用作控制流变性、保水性和表面特性的添加剂。应用的实例包括：成膜、碳水化合物的低血糖指数来源、纹理增强剂、皮肤填充剂、维生素和其他光敏生物活性化合物的稳定剂、体质颜料(pigment extender)、医学润滑剂和赋形剂、药物递送剂。本发明的组合物还可以被用来提高防晒配方的UV保护并且提高生物活性物质和其他对光不稳定的化合物(如防晒霜、维生素和药物)的光稳定性。在由同一申请人与本申请同时提交的标题为“多官能糖原和植物糖原添加剂(polyfunctional glycogen and phytoglycogen additives)”的国际专利申请中详细的说明了各种应用，并且其内容通过引用以其整体并入本文。
[0112]本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒作为成膜剂是特别有用的。因为纳米颗粒可能是单分散的、均匀密堆积膜。组合物形成具有低水活度(water activity)的稳定膜。水活度表征了材料可以结合水的程度以及水分子可以在材料中迁移的程度。水活度在需要在产品的物理强度和产品的口味之间寻求平衡的食品工业中是重要的，产品物理强度随其干燥而提高，而产品口味经常随含水量的提高而增加。水活度的控制在含有多种结构不同组分的食品产品中尤其重要，例如松饼的主体和在松饼顶部的糖霜涂层。本发明的组合物可以被用作食品产品的不同组分之间的隔离膜。例如，如果食品产品相对干燥，在将另一组分与第一种组分接触之前，将本发明的单分散性植物糖原纳米颗粒的浓缩含水溶液喷散在食品产品第一组分的表面上，并且使其干燥。对于食品产品已经含有大量水分的情况，可以将植物糖原纳米颗粒的细粉洒在第一食品组分的表面上直至形成了连续膜，之后使其接触
13
CN 105555856 A
说 明 书
11/14页
第二组分。组合物形成隔离膜并且本质上减少了水分子从一种食品组分向另一食品组分的扩散。这种隔离膜形成特性也可以被用在不希望水在组分之间扩散的药品和维生素片的制造中。
[0113]在一个实施方式中，本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物被用于药物递送。单分散性植物糖原纳米颗粒是无毒的，没有已知的变应原性，并且可以被人体的糖原分解酶(例如淀粉酶和磷酸化酶)降解。酶降解的产物是无毒的中性葡萄糖分子。纳米颗粒表现出优异的化合物承载能力，因为它们可以与药物直接结合或通过分子间隔子或系链结合。可以使用特异性组分靶向分子(诸如叶酸、抗体或核酸适体)进一步修饰药物结合的纳米颗粒。低多分散性允许均匀的衍生化和药物分布、以及相关可预测的药代动力学。最后，紧凑的球形分子、中性电荷和高亲水性与有效的细胞摄取相关。[0114]实施例1.从甜玉米粒提取糖原(植物糖原)
[0115]在20℃下将1kg冻甜玉米粒(75％含水量)与2L去离子水混合，并且在捣碎机中在3000rpm下粉碎3分钟。在4℃下将糊状物在12,000x g下离心15分钟。使用具有0.1μm孔径的膜滤器，使合并的上清部分经受CFF。使用具有500kDa的MWCO的膜，并且在室温和6的体积倍数下，通过间歇渗滤进一步纯化滤出液(体积倍数是在渗滤过程中导入到操作中的总mQ水体积与滞留体积的比)。
[0116]将滞留部分与2.5体积95％乙醇混合，并且在4℃下在8,000x g下离心10分钟。将滞留物与2.5体积95％的乙醇混合并且在4℃下在8,000x g下离心10分钟。将含有植物糖原
然后研磨至45目。干燥的植物糖原的重量为97g。的沉淀在烘箱中在50℃下干燥24小时，
[0117]根据DLS测量，所产生的植物糖原纳米颗粒具有为83.0nm的颗粒尺寸直径和0.081的多分散指数(图2)。[0118]实施例2
[0119]将250g在凹陷期收获的NK199品种的干玉米粒研磨至小于0.5mm的颗粒尺寸。在20℃以适度搅拌20分钟进行冷水提取。通过在8,000x g离心沉淀出不溶性组分。使用10.0、1.0和0.1μm的过滤介质孔径对上清液进行多级微滤。在室温和6的体积倍数下，使用300kDa的MWCO进行交叉流过滤(渗滤)。将滞留物与2.5体积95％乙醇混合并且在4℃在8,000x g下离心10分钟。将含有植物糖原的沉淀在烘箱中在50℃下干燥24小时，然后研磨至45目。干燥的植物糖原的重量为17.5g。[0120]根据DLS测量，所生产的植物糖原纳米颗粒具有为63.0nm的颗粒尺寸直径和0.053的多分散指数(图3)。
[0121]实施例3.本发明的玉米粒植物糖原的表征
[0122]通过DLS来表征本发明的如在实施例2中制备的植物糖原纳米颗粒，且结构示于表1中。所有品种均为标准型(su)。
14
CN 105555856 A
说 明 书
12/14页
[0123]
[0124]
所生产的植物糖原纳米颗粒具有处于0.071和0.129之间的多分散指数，平均多分
散指数为0.10。
[0126]实施例3.本发明的玉米粒植物糖原的表征
[0127]表征了如实施例2使用在凹陷期收获的se和sh类型的玉米粒制备的植物糖原纳米颗粒，并且结果示于表2中。
[0125]
15
CN 105555856 A
说 明 书
13/14页
[0128]
实施例4
[0130]以从5至30w/w％的各浓度，将本发明的干燥纳米颗粒组合物溶解于水中。结果示于图4中。所提供的溶液是澄清的，在最高达按重量计25％的浓度下无显著粘度。对于大于25％w/w的浓度，粘度显著提高。对于高于20％w/w的浓度，溶液表现出较强的剪切稀化特性。
[0131]参考文献
[0132]1.Manners,Carbohydrate Polymers,16(1991)pp.37-82.[0133]2.Pflüger,1894,Archiv.für Physiologie,pp 394-396.[0134]3.Somogyi,1934,J.Biol.Chem.,104:245-253.
[0135]4.Stetten et al.,1956.J.Biol.Chem.222,587-599.[0136]5.Bell and Young,1934,Biochem.J.28:882-890.[0137]6.Orell et al.,1964,J.Biol Chem.,239:4021-4026.[0138]7.Bueding and Orrell.J.Biol Chem.1961,236:2854-7.
[0139]8.Huang and Yao,Carbohydrate Polymers,2011,83:1165-1171.[0140]9.Meléndez-Hevia et al.,(1993)Optimization of molecular design in the evolution of metabolism:the glycogen molecule,Biochem.J.295:477-483.[0141]10.Meléndez et al.,(1997)How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose？A problem of physical constraints in structure building.J.Mol.Evol.45:446-455.
16
[0129]
CN 105555856 A[0142]
说 明 书
14/14页
11.Meléndez et al.,(1998)Physical constraints in the synthesis of
glycogen that influence its structural homogeneity:a two-dimensional approach.Biophys.J.75:106-114.[0143]12.Meléndez et al.,(1999)The fractal structure of glycogen:a clever solution to optimize the cell metabolism.Biophys.J.77:1327-1332.[0144]13.DiNuzzo M.(2013)Kinetic analysis of glycogen turnover:relevance to human brain(13)C-NMR spectroscopy.Journal of cerebral blood flow and metabolism 33:1540-1548.[0145]14.Thompson,D.B.(2000)Carbohydr.Res.43:223-239。
17
CN 105555856 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
图2
18
CN 105555856 A
说 明 书 附 图
2/2页
图3
图4
19
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容