肝细胞癌的复发预测及治疗中lncRNA01622的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1115106 A(43)申请公布日 2020.08.11

(21)申请号 202010399456.5(22)申请日 2020.05.12

(71)申请人 广州医科大学附属第五医院

地址 510700 广东省广州市黄埔区港湾路

621号(72)发明人 姜春林　周新科　黄冠群　刘阳萍　

任栋　(74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限

公司 11228

代理人 武君(51)Int.Cl.

C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/113(2010.01)A61K 31/7105(2006.01)A61P 35/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图4页

A61P 1/16(2006.01)

()发明名称

肝细胞癌的复发预测及治疗中lncRNA01622的应用(57)摘要

本发明首次证实lncRNA01622的高表达能够作为诊断或预测HCC复发的指标；并且可喜的是，沉默lncRNA01622能够预防或治疗肝癌，对抗癌细胞成瘤有显著的抑制效果。本发明为此提出两方面的应用：实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂在制备肝细胞癌患者复发诊断或复发预测的试剂的应用，以及沉默LNCRNA01622的试剂在制备肝癌预防或治疗药物的应用。这些应用为肝细胞癌的临床预防及治疗提供新的标志物及治疗靶点。

CN 1115106 ACN 1115106 A

权　利　要　求　书

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1.实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂在制备肝细胞癌患者复发诊断或复发预测的试剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂用于检测肝细胞癌患者的肝细胞癌组织或肝细胞癌细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂通过采用RT-PCR或探针杂交的方式进行检测。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂包括与LNCRNA01622杂交的探针或特异性检测LNCRNA01622的引物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：复发预测包括预测无复发生存率或无复发生存时间。

6.沉默LNCRNA01622的试剂在制备肝癌预防或治疗药物的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肝癌预防或治疗药物能够抑制肝癌细胞成瘤。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述沉默的方式包括siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肝癌为肝细胞癌。

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肝细胞癌的复发预测及治疗中lncRNA01622的应用

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技术领域

[0001]本发明属于生物医药领域，更具体地涉及肝细胞癌的复发预测及治疗中lncRNA01622的应用。

背景技术

[0002]肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是肿瘤相关死亡的第四主因。尽管近年来HCC在系统性治疗方面取得了巨大的进步，但是HCC患者的5年生存率仍然不超过20％。造成HCC患者生存率低下的主要原因是出现局部和远处肿瘤的复发。[0003]近年来，长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在肿瘤发生发展中的作用逐渐成为研究热点。与miRNA功能相似，lncRNA是一类长度大于200核苷酸且不具备编码作用的RNA。但相对于miRNA靶向作用于靶基因3’非编码区(3’-UTR)这一简单的作用机制，lncRNA通过多种生物学作用，多层面参与转录、转录后表观遗传及翻译水平。lncRNA的主要作用机制包括：1.影响编码蛋白基因上游启动子区的转录，其表达水平；2.作为miRNAs的吸附分子，阻断miRNA对靶基因的抑制或降解，miRNA靶基因的表达；3.作为结构组分，lncRNA可与蛋白质结合，调节相应蛋白的活性或细胞内定位。目前，大量的研究证实lncRNA涉及肿瘤细胞多种生物学功能。因此，寻找HCC早期复发相关的lncRNA，探索其在HCC复发过程中的生物学功能及其分子机制，将为HCC的临床预防及治疗提供新的标志物及治疗靶点。

发明内容

[0004]发明目的：

[0005]本发明的目的是为HCC的临床预防及治疗提供新的标志物及治疗靶点——lncRNA01622。

[0006]术语解释：[0007]“LINC01622”(long intergenic non-protein coding RNA 1622，lncRNA01622)，Entrez Gene:285768，本文LINC01622表达水平主要包括LINC01622的转录水平，lncRNA01622基因具有两个转录本，分别为NR_027116和NR_027115，如无特别说明，本文检测lncRNA01622表达水平包括检测NR_027116水平和NR_027115水平。[0008]“复发”：是指患者经过治疗，肿瘤病灶清除一段时间后，又出现肿瘤，其通常包括局部复发、区域性复发以及远处复发。[0009]“复发预测”是指患者经过治疗，肿瘤病灶清除一段时间后，对未来发生复发的风险进行预测，通常包括预测患者复发风险高低、预测患者无复发生存率，预测患者无复发生存时间等。

[0010]“复发诊断”是指患者经过治疗，肿瘤病灶清除一段时间后，对患者是否发生复发进行判断或辅助判断。

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发明详述：

[0012]本发明前期通过大量临床标本研究、lncRNA芯片分析、信号通路生物学功能分析等技术手段，意外地发现了HCC复发标志物LINC01622。

[0013]实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂在制备肝细胞癌患者复发诊断或复发预测的试剂的应用。实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂用于检测取自肝细胞癌患者的肿瘤样本。优选地方案中，实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂用于检测肝细胞癌患者的肝细胞癌组织或肝细胞癌细胞。实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂通过采取检测mRNA的方式进行，例如优选的RT-PCR、探针杂交方式。更具体地方案中，所述实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂包括与LNCRNA01622杂交的探针或特异性检测LNCRNA01622的引物，探针和引物的设计可根据转录产物序列进行常规设计。在具体地实施方案中，复发诊断可以根据大量临床肝细胞癌患者样本的LNCRNA01622检出水平(如可区分无复发和复发的患者的检测值)，设定适当的阈值，当大于所设阈值，则可判定或辅助判定肝细胞癌患者出现复发。在具体地实施方案中，复发预测可以根据大量临床肝细胞癌患者样本的LNCRNA01622检出水平(如中位值)，设定适当的阈值，当大于所设阈值，则可预测肝细胞癌患者出现复发的风险高。在进一步优选地方案中，所述复发预测包括预测无复发生存率或无复发生存时间。[0014]沉默LNCRNA01622的试剂在制备肝癌预防或治疗药物的应用。在一些方案中，所述肝癌预防或治疗药物能够抑制肝癌细胞成瘤。在一些方案中，所述成瘤包括降低肝肿瘤负荷、体积、肿瘤等指标。在一些方案中，所述沉默的方式包括siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。这里沉默的方式还包括对沉默LNCRNA01622的试剂进行一些成药修饰。具体地方案中，所述肝癌为肝细胞癌。在一些方案中，所述沉默LNCRNA01622的试剂能上调以下任意miRNA：miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940。具体地方案中，沉默LNCRNA01622的试剂能同时上调以下miRNA：miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940，进而发挥抗肝癌作用。[0015]发明优点：

[0016]本发明首次证实lncRNA01622的高表达能够作为诊断或预测HCC复发的指标；并且可喜的是，沉默lncRNA01622能够预防或治疗肝癌，对抗癌细胞成瘤有显著的抑制效果。本发明为此提出两方面的应用：实施检测LNCRNA01622表达水平的试剂在制备肝细胞癌患者复发诊断或复发预测的试剂的应用，以及沉默LNCRNA01622的试剂在制备肝癌预防或治疗药物的应用。这些应用为肝细胞癌的临床预防及治疗提供新的标志物及治疗靶点。附图说明

[0017]图1：复发与无复发HCC组织样本中lncRNA01622的表达水平；non表示无复发HCC组织样本，Recur表示复发HCC组织样本；[0018]图2：LNCRNA01622的表达水平与无复发生存率的关系；L表示LNCRNA01622低表达，H表示LNCRNA01622高表达；[0019]图3：高表达或沉默LNCRNA01622对HCC体内成瘤的影响；A为不同细胞中LNCRNA01622的表达情况，B为高表达LNCRNA01622的细胞模型，C为低表达LNCRNA01622的细胞模型，D为移植瘤的外观，E为HCC组织H&E染色，F和G为移植瘤的体积，H和I为移植瘤的重量；

[0020]图4：高表达或沉默LNCRNA01622对HCC细胞模型的悬浮成球能力和凋亡能力的影

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响；

图5：TargetScan预测分析；

[0022]图6：高表达LNCRNA01622对HCC细胞中miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940表达水平的影响；[0023]图7：沉默LNCRNA01622对HCC细胞中miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940表达水平的影响；

[0024]图8：高表达miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940对高表达LNCRNA01622细胞的悬浮成球能力和凋亡能力的影响。

具体实施方式

[0025]本发明的目的、特征及效果将结合实施例进一步详细描述。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规操作，如文献书籍报道的调节或试剂厂家推荐的方法实现。[0026]具体实施例1、lncRNA01622高表达预示着更早的HCC复发[0027]1.1 HCC组织样本临床分析

[0028]对收集的HCC组织样本根据无复发生存随访分析的数据，分为无复发HCC组织样本(简称non，255例)，复发HCC组织样本(简称recur，31例)，检测所有组织样本的lncRNA01622的表达水平。

[0029]lncRNA01622的表达水平的检测方法：使用Trizol试剂提取RNA，将2μg RNA进行逆转录反应，反应完成后将cDNA保存于-20℃备用。按照检测试剂盒说明书准备DNA扩增所需要的SYBR Green mix(Roche)及相关引物(引物委托锐博生物设计与合成)。在Bio-rad实时定量PCR仪，根据试剂盒说明书要求设置扩增反应条件，进行40个循环反应。GAPDH基因作为内参，所有样本至少设置3个副孔。目的基因DNA相对表达量通过Schmittgen and Livak2-ΔΔCt

公式计算得出。

[0030]结果如图1所示，在复发HCC组织样本中，lncRNA01622的表达水平显著高于无复发HCC组织样本。

[0031]1.2无复发生存随访分析

[0032]根据所有HCC组织样本中lncRNA01622的中位值，区分lncRNA01622高表达和低表达，进一步通过无复发生存随访分析，结果如图2所示，HCC组织中高表达lncRNA01622预示着HCC患者复发。[0033]综上所述，lncRNA01622高表达可用于预测HCC的复发，因此检测lncRNA01622表达水平的试剂可用于制备预测HCC复发的试剂的用途。[0034]具体实施例2、沉默lncRNA01622抑制HCC细胞体内成瘤能力[0035]2.1体外细胞培养

[0036]为了明确lncRNA01622表达水平对HCC细胞体内成瘤能力的影响，我们首先在多个HCC细胞中检测了lncRNA01622的表达水平。[0037]细胞培养方案如下：LO2、97H、Hep G2、QGY-7703、Hep 3B、PLC、SMMC7721和Huh 7细胞系培养于二氧化碳浓度为5％，温度为37℃的细胞培养箱中。细胞生长于25cm2培养瓶中，加入5毫升RPMI 10培养基(Invitrogen,USA)，培养基中加入终浓度为10％的胎牛血清，

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200mg/ml青霉素，250mg/ml氯霉素，500mg/ml谷胺酰胺。观察细胞状态及细胞密度，定期更换培养基(一般2天左右)，待细胞密度至80％时适宜实验使用。[0038]检测细胞系中lncRNA01622表达水平，测试方法同具体实施例1中所述，结果如图3A所示，lncRNA01622在HCC中的表达水平不同程度的高于正常肝上皮细胞LO2。[0039]2.2构建稳定沉默及过表达lncRNA01622细胞系[0040]利用慢病毒，我们构建了稳定沉默及过表达lncRNA01622细胞系，从锐博生物购买LINC01622重组腺病毒和sh-LINC01622重组腺病毒(1-5号)，通过慢病毒转染至对应的HCC细胞中，通过测定细胞系中lncRNA01622表达水平确定构建的结果，测试方法同具体实施例1中所述。

[0041]结果如图3B和图3C所示，97H和Hep G2为过表达lncRNA01622细胞系，Huh 7和SMMC7721为沉默lncRNA01622细胞系。[0042]2.3构建裸鼠皮下成瘤模型

[0043]将6周龄的BALB/c-nu裸鼠随机分为3组(每组6只裸鼠)，将不同数量的HCC细胞接种在裸鼠背部的皮下组织中。接种一周以后，按2mg/kg的给药剂量每四天一次腹腔注射阿霉素，连续给药4周。肿瘤体积用游标卡尺测量，体积用(L×W2)/2计算，同时使用IVIS活体成像系统观察(IVIS imagining system,Caliper)肿瘤形成的大小，实验结束后，安乐死动物并取出肿瘤，称量后保存在液氮中。测定裸鼠肝细胞癌组织中lncRNA01622表达水平，测试方法同具体实施例1中所述。对肿瘤组织进行H&E染色。[0044]结果如图3D所示，过表达lncRNA01622升高了Hep G2细胞体内成瘤能力，而沉默lncRNA01622则能抑制Huh 7细胞体内成瘤能力。H&E染色结果如图3E所示，过表达lncRNA01622增加肝肿瘤的负荷，而沉默lncRNA01622降低了肝肿瘤的负荷。此外，lncRNA01622增加肝肿瘤的体积和重量，而沉默lncRNA01622降低了肝肿瘤的体积和重量(图3F-I)。

[0045]综上所述，沉默lncRNA01622抑制HCC细胞体内成瘤能力。因此，沉默lncRNA01622的试剂可用于制备治疗HCC的药物。[0046]具体实施例3、沉默lncRNA01622抑制HCC细胞悬浮成球能力和抗凋亡能力[0047]3.1悬浮成球实验

[0048]在低吸附板(Corning)中种入500个细胞/孔。细胞悬浮培养并加入无血清DMEM-F12(BioWhittaker)。培养10-12天，对细胞球计数并于倒置显微镜下拍照，原则为紧密、成球直径大于50μm的非粘附细胞团。悬浮成球能力计算公式：成球效率＝成球的数量/500×100％。

[0049]悬浮成球实验结果如图4A和B所示，沉默lncRNA01622能抑制HCC细胞的悬浮成球能力，而高表达lncRNA01622则增加其悬浮成球能力。[0050]3.2凋亡实验

[0051]细胞凋亡的检测采用Annexin V-FITC/PI检测试剂盒(凯基生物)，操作按试剂说明书操作：离心弃上清并用PBS洗涤细胞1次，同前弃尽上清后，按每1×105细胞加入195μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞后，加入5μl Annexin V-FITC混匀室温避光孵育10min。离心弃上清后，加入190μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10μl PI染液混匀后冰浴。随即进行流式细胞分析仪检测，调整并收集每个样品的前散射光(FSC)、侧散射光(SSC)、绿

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光(Annexin V-FITC)和红光(PI)四个通道的信号，并以FSC/SSC作散点图圈出主细胞群，再以Annexin V-FITC/PI对主细胞群作图分出Annexin V-FITC阳性、PI阴性或阳性的凋亡细胞群，得到每组细胞的凋亡率。[0052]凋亡实验结果如图4C和D所示，沉默lncRNA01622能增加Huh 7和SMMC7721细胞的凋亡，而高表达lncRNA01622则减少97H和Hep G2细胞的凋亡。[0053]具体实施例4、lncRNA01622吸附抑制miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940[00]4.1 TargetScan预测[0055]利用miRNA结合位点预测软件(TargetScan 7.0)预测lncRNA01622上潜在的全部miRNA的结合位点，结果如图5所示，并挑选出测出的结合位点≥4个的miRNA。进一步选定在TCGA数据库中HCC组织中能用测序方法检测到的，丰度较高的miRNA为候选，经过多轮筛选和分析，明确了lncRNA01622吸附抑制的miRNA。[0056]4.2 lncRNA01622过表达或沉默对miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940水平的影响

[0057]通过检测mRNA表达水平，结果如图6和7所示，过表达lncRNA01622能抑制miR-146a-5p、miR-532-5p和miR-940的表达，沉默lncRNA01622则增加miR-146a-5p、miR-532-5p和miR-940的表达。[0058]4.3 lncRNA01622过表达及miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940高表达稳定细胞系中悬浮成球实验和抗细胞凋亡实验。

[0059]在lncRNA01622过表达细胞株的基础上，构建miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940高表达稳定细胞系，测试细胞模型的悬浮成球实验和抗细胞凋亡实验。测试方法同具体实施例3。

[0060]结果如图8所示，高表达miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940能够减弱lncRNA01622高表达对97H和Hep G2细胞悬浮成球能力及抗凋亡能力的促进作用。[0061]综上所述，lncRNA01622通过吸附抑制miR-146a-5p、miR-532-5p或miR-940发挥抑制HCC细胞悬浮成球能力及抗凋亡能力。

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