EMSA实验流程

细胞：

1.1 在EP管中准备单细胞混悬液

1.2 进行4度，500g离心后去上清 (离心后细胞体积不得超过250 ul)。

1.3 加入150 ul NucBuster Reagent 1 /50 ul 细胞体积（按照细胞体积进行

试剂比例调整），重悬细胞（1.5 ml 离心管）。 1.4 震荡混匀15秒，冰上静置5分钟 （重复两次）。

1.5 进行 4度16000g 离心后去上清（上清为细胞质组分）。 1.6（可选细胞质清洗步骤）加入500 ul 预冷PBS缓冲液重悬、离心、去上清。 1.7 每50ul细胞体积，按比例加入预先混合的（1ul 复合蛋白抑制酶（100X），

1ul 100mM DTT 以及75 ul NucBuster Extraction Reagent 2），进行重悬。 1.8 震荡15秒，冰上静置 5分钟（重复两次）。 1.9 进行4度16000g离心后，将上清转移至新的1.5ml离心管 （此上清为细胞

核组分）。此上清可立即用于EMSA实验，或分装后存放于-80度。

组织：

1.1 用液氮将组织磨碎，将组织收集到EP管中，根据组织体积按比例加入NucBuster Reagent 1试剂，利用头重悬组织。 1.2 震荡混匀15秒，冰上静置5分钟 （重复两次）。 1.3 进行 4度16000g 离心后去上清。 1.4 下同细胞部分的1.3-1.9

2、 探针合成与标记

2.1 正反配对并包含转录因子结合位点的两条生物素标记的引物进行退火反应，得到25 uM （未标记）或 1 uM （标记）终浓度双链引物，-20度保存备用。使用NEB2 buffer，在PCR仪或者加热块上进行，98度5分钟，逐渐冷却至室温即可。

3、 4-6% 非变性EMSA胶（0.5 X TBE）配置

1 ml 4 ml 0.625 ml 14.375 ml 0.3 ml 20 ul total 20 ml 10 X TBE buffer (PH = 8.3) 30% Acr-Bis gel 80% glycerol H2O 10% APS TEMED 注意事项： 必须采用非变性胶（即不能加入SDS等变性试剂），并需采用TBE缓冲液。凝胶配置详见凝胶试剂盒说明书。

4、

EMSA结合反应

终浓度 反应1 反应2 反应3 （阴性对照） （阳性对照） （野生型EBNA探针 EBNA探针 /突变型热探针） 7.8 ul 7.8 ul 7.8 ul 2 ul 2 ul 2 ul 反应4 （竞争反应）冷探针 6.8 ul 2 ul 纯水 10x binding 1X buffer 1 ug/ul 50 ng/ul 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul Poly(dIdc) 1M KCL 30.1 mM 0.6 ul 0.6 ul 0.6 ul 0.6 ul 100 mM 2 mM 0.4 ul 0.4 ul 0.4 ul 0.4 ul MgCl2 50% glycerol 7.5% 3 ul 3 ul 3 ul 3 ul 4mM EDTA 0.1 mM 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul 1% NP40 0.063% 1.2 ul 1.2 ul 1.2 ul 1.2 ul 未标记探针25 pmol --- --- --- 1 ul （25 uM） 细胞核蛋白 2 ug 2 ul 2 ul 2 ul 2 ul 标记探针（1 20 fmol 1 ul 1 ul 1 ul 1 ul uM） 总体积 - 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

注意事项：按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入热探针前先混匀，避免剧烈震荡，并且室温放置10分钟，从而消除可能发生的探针与蛋白的非特异性结合，并且让冷探针优先反应，然后加入热探针（或对应抗体），混匀，室温放置20分钟。加入 5ul 5x 上样缓冲液，混匀后立即上样。

5、 蛋白电泳

5.1 采用预先配置的4-6%的0.5xTBE非变性胶（也可用预制EMSA胶）。具体的

浓度取决于DNA和蛋白复合物的大小。

5.2 用0.5XTBE buffer作为电泳液，按照120V 电泳预电泳 10 分钟。 5.3 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。 5.4 按照100V （8x8x0.1 cm的凝胶）进行稳压电泳，可以在冰水浴中进行低温

电泳。电泳至EMSA样品中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。此时EBNA对照的样品移动至溴酚蓝后方。

6、 转膜

6.1 取一张和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好正面标记，用0.5xTBE

浸泡约10分钟。

6.2 采用western所使用的湿法电转膜装置，对凝胶、尼龙膜、转膜滤纸、转膜海绵进行三明治叠放。以预冷至10度的0.5xTBE作为转膜液，需要带手套只对尼龙膜的边角用镊子进行夹取，避免污染。

6.3 采用380 mA（约100V）进行稳流转膜30-60分钟。 6.4 转膜完毕后，将带有染料的膜正面朝上放置与干纸巾上1分钟，凝胶上此时应该已无染料残留。保持尼龙膜湿润，立即进行紫外交联。

7、 紫外交联

采用2nM紫外波长，120 mJ/cm2，交联60秒。或312 nm紫外波长照胶仪，正面朝下，交联10-15分钟。

注意事项： 交联后，可立刻进行化学发光显色操作，或将尼龙膜室温干燥保存数日，需要避免尼龙膜在下次实验前变湿。

8、 化学发光法检测

8.1 水浴慢慢加热Blocking buffer 至37-50度，使所有沉淀溶解。

8.2 封闭： 取合适大小容器，加入20 ml Blocking buffer，放入交联过的尼龙膜，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。

8.3 预先配置含有66.7ul stabilized streptavidin-horseradish peroxidase conjugate （Streptavidin-HRP）的20 ml Blocking buffer （1： 300稀释） 8.4 抗体孵育： 去除用于尼龙膜封闭的blocking buffer，加入Streptavidin-HRP conjugate buffer， 缓慢摇动15分钟 8.5 利用4x wash solution配置1x wash solution 160 ml。

8.6 洗涤：将尼龙膜转移至另一个装有20 ml 洗涤液的容器内，漂洗1分钟。去除洗液，加入15-20ml洗涤液，缓慢摇动5分钟后倒掉残液， 重复洗涤4次。 8.7 平衡：将尼龙膜转移至另一个装有30 ml底物平衡液 （substrate equilibration buffer），缓慢摇动5分钟。

8.8 预制底物显影液Substrate working solution （6ml Luminol/Enhancer Solution + 6 ml Stable Peroxide Solution）。避免强光照射。

8.9 将尼龙膜夹出，小心将其中一个角在纸巾上触碰，去掉多余的buffer，将膜放置于干净的容器中，将底物显影液倒入完全覆盖在膜上，静置5分钟。 8.10 将尼龙膜至于两片塑料薄膜间，去除多余的褶皱与气泡，放置于标准的CCD显影设备中，进行适度曝光和拍摄。