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超临界CO2萃取灵芝子实体中的三萜类成分

来源:赴品旅游
第33卷第17期中国中药杂志V01.33.Issue172008年9月ChinaJournalofChineseMateriaMedicaSeptember,2008PharmaceuticalcharacteristicsofbrucinestealthliposomesCHENJunl,一,WANGWeil,CAIBao—chan92,HUWei2,WANGLi-jie2(1.CollegeofPharmacy,2.五angsuKeyLaboratoryofChineseMedicineProcessing,Na彬ngUmversi秒ofChineseMedicine,Nanjing210029,China)[Abstract]Objective:Topreparebrucinestealthliposomesandcomparetheinvitrocharacteristicswithbmcineconventionalliposomes.Method:Brucinestealthliposomesandconventionalliposomeswerebothpreparedbyammoniumsulfatetransmembranegradients.Theencapsulationefficiency,particlesize,讥vitroreleasepmfd∞andstabilitywerecomparedrespectively.Result:Theencapsulationefficiencyofbrucinestealthliposomesandconventionalliposomeswere(80.7±0.5)%,and(80.54-0.3)%,respec-tively.ThemPAll[1pariclesizeswere103.5amand169.4砌,respectively.WhetherratplasmaW88addedornot,thereleaserateanddegreeofbmcinestealthliposomesweresignificantlylowerthanthoseofconventionalliposemes.Brucinestealthliposomesweremorestablethanconventionalliposemes.Conclusion:Astheantitumordurgdeliverysystem,theinvitrocharacteristicsofbmcmestealthliposemes啪moresatisfactorythanthecorrespondingconventionalliposomes.[Keywords]brucine;stealthliposemes;releaseprofile;stability[责任编辑鲍雷】超临界C02萃取灵芝子实体中的三萜类成分宋师花1…,贾晓斌1,陈彦1,孙,陈斌1,王丽静2,赵呈雷1(1.江苏省中医药研究院中药新型给药系统应用技术重点研究室,江苏南京210028;2.江苏大学,江苏镇江212013)[摘要]目的:筛选超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分的最佳工艺条件。方法:采用RP・HPLC测定灵芝酸B的含量、可见分光光度法测定灵芝总三萜含量,设计正交试验优化超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分的工艺条件。结果:超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分的最佳工艺条件:萃取压力为25MPa,萃取温度为45℃,萃取时间为1.5h,夹带剂(95%乙醇)用量为3mL・g~。结论:超临界cO:萃取灵芝子实体中三萜类成分具有萃取效率高、萃取时间短、操作简单等优点,其方法可靠,切实可行。[关键词]灵芝;超临界C02萃取;正交试验;灵芝总三萜;灵芝酸B;RP-HPLC[中图分类号]R284.1【文献标识码】A[文章编号]1001-5302(2008)17-2104-04灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,药用部成分灵芝三萜具有抗肿瘤、抗突变、抗氧化、清除自位为子实体、孢子体、菌丝体,2005年版《中国药典》由基、提高机体免疫力等作用旧引。该类化合物的传收载的作为药材灵芝来源的是赤芝C,anodermaluci-统提取方法主要有氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂提dum(Leyss.exFr.)Krast.和紫芝G.sinenseZhao,取ⅢJ,其提取效率较低,有溶剂残留,毒性较大。超XuetZhang的干燥子实体…,具有补气安神,止咳临界CO:萃取具有萃取效率高,有机残留少,绿色无平喘之功效。现代药理研究表明,灵芝中主要有效污染等优势,是~种很有发展前景及潜力的方法,但文献报道以该法萃取灵芝孢子中三萜类成分居[收稿日期】2008-024)8多【6刁J,而以该法萃取灵芝子实体中三萜类成分的报[基金项目】江苏省公益专项(BM2007701)道较少,其考察方法也多采用紫外分光光度法测定[通讯作者】‘陈彦,Tel:(晒)85637809。E.mail:ychen202@ya-灵芝总三萜的含量L8J,而用RP.HPLC测定灵芝酸Bboo.toni.∞・2104・万 方数据第33卷第17期2008年9月中国中药杂志ChinaJournalofChineseV01.33,Issue17MateriaMedicaS呵岫抽,2008的含量并以其作为考察指标的未见报道,因此本试验以RP.HPLC测定的灵芝酸B含量并结合灵芝总三萜含量、固形物含量为考察指标,采用正交试验筛选超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分的最佳工艺条件,为灵芝子实体中三萜类成分的提取提供一种可靠、可行的新方法。1仪器与药品HA221—04(50)一25型超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司);Waters高效液相色谱仪(Waters600Controller,Waters2996Photodi-odeArrayDetector);UV一2802型紫外-可见分光光度计(上海尤尼克仪器有限公司)。灵芝子实体购自江苏盐城神农保健食品有限公司,经中国科学院微生物研究所文华安研究员鉴定为赤芝Ganodermalucidum(Leyss.暇Fr.)Krast.的干燥子实体;熊果酸对照品(批号110742-200516,供含量测定用,中国药品生物制品检定所);灵芝酸B(购于中国医学科学院药物研究所,纯度为98.0%);甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯;水为重蒸水,其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1正交试验设计经预试验可知,影响超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分的因素主要为萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂(95%乙醇)用量4个因素,因此拟定3个水平,以总三萜含量、灵芝酸B含量、固形物含量为考察指标,采用k(34)正交表安排试验,见表1。表1正交试验因素水平2.2样品制备采用一级萃取、二级分离的方法对灵芝三萜进行萃取,萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂用量按照表1条件进行正交试验;设定分离釜I压力为7MPa,温度为50℃;分离釜Ⅱ压力为4MPa,温度为36℃;萃取装置内C02流量控制在30L・h~。超临界CO:萃取灵芝三萜类成分流程:将灵芝子实体粉碎,过12目筛,取100g灵芝子实体粗粉万 方数据装入萃取釜中,打开CO:钢瓶(需保持出口压力在4MPa以上),同时调节萃取釜、分离釜I、分离釜Ⅱ温度达设定温度,然后加压至设定压力,调节CO:流量,使超临界CO:流体在设定的压力、温度下进行萃取循环,当达到试验设定的萃取时间后,从分离釜I和分离釜II出料口接收萃取液,定容至500mL,即得灵芝子实体超临界CO:萃取液样品,备用。2.3灵芝总三萜含量测定2.3.1对照品溶液的制备精密称取熊果酸对照品2.25mg,置于10mL量瓶中,加无水乙醇适量使溶解,定容,摇匀,即得。2.3.2显色方法及检测波长的确定[81取上述对照品溶液0.5mL,置10mL具塞试管中,沸水浴中挥干溶剂,依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL,高氯酸0.8mL,密塞,于60℃水浴中加热15min,取出,冰水浴中冷却5min,加冰醋酸5mL,摇匀。用UV一2802型紫外一可见分光光度仪进行全波长扫描,在543nm处有最大吸收峰,故选择检测波长为543nm。2.3.3标准曲线的制备分别精密吸取熊果酸对照品溶液0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mL,按上述条件及步骤在543nm处测定吸光度,以吸光度为纵坐标(y),熊果酸对照品含量(斗g)为横坐标(x),绘制标准曲线,线性方程为Y=3.6444X+0.005,r=0.9995,结果表明熊果酸在0.0450—0.1800mg呈现良好的线性关系。2.3.4供试品溶液制备及含量测定分别取灵芝子实体超临界CO:萃取液样品60止,按2.3.2项下测定吸光度,根据标准曲线计算总三萜含量,见表2。2.4灵芝酸B含量测定2.4.1色谱条件AlhimaC18色谱柱(4.6n姗×250ITlln,5lain);流动相乙腈(A)旬.1%磷酸水溶液(B),采用梯度洗脱,0rain30%A,40min32%A;流速1.0mL・min~;检测波长252nm;柱温25oC;进样量10斗L。2.4.2标准曲线的绘制精密称取灵芝酸B对照品2.375rag,置5mL量瓶中,加甲醇适量使溶解,定容,制成质量浓度为0.475g・L。1的灵芝酸B对照品储备液。吸取灵芝酸B对照品储备液适量,分别制成质量浓度为0.0475,0.0950,0.1425,0.1900,0.2375g・L。1的灵芝酸B对・2105・第33卷第17期2008年9月中国中药杂志ChinaJournalofChineseV01.33.IE眦17Septmber,2008MateriaMedica照品溶液。吸取灵芝酸B对照品溶液10汕L进样,测定其峰面积。以对照品浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线,得灵芝酸B标准曲线Y=911.04X一3.758,r=0.9999,结果表明,灵芝酸B在O.0475—0.2375g・L。1呈良好的线性关系。2.4.3测定取灵芝子实体超临界CO:萃取液样品,过O.45岬微孔滤膜,取续滤液,分别进样10止,按上述色谱条件进行分析,计算灵芝酸B的含量,结果见表2。2.5灵芝固形物含量测定精密量取灵芝子实体超临界CO:萃取液样品10mL,置已干燥恒重的蒸发皿中,水浴挥干溶剂,置105℃烘箱中恒重,称定,计算固形物的含量,结果见表2。表2正交试验结果mg・g。12.6正交试验结果分析用k(34)正交表进行试验设计优化,极差分析和方差分析见表3,4。表3正交试验极差分析通过极差分析可知,超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分以总三萜含量为考察指标的最佳工・2106・万 方数据表4正交试验方差分析注:F临界值为19.oo艺条件为A:B:C:D,,以灵芝酸B量为考察指标的最佳工艺条件为A:B:C2D,,以灵芝固形物含量为考察指标的最佳工艺条件为A:B:c2D:,综合这3个考察指标可知,萃取压力、萃取温度、萃取时间这3个因素对萃取的影响一致,最佳条件均为A:B:c2,方差分析表明,萃取压力对灵芝总三萜含量、固形物含量影响显著(P<0.05),所以选择萃取条件:萃取压力为25MPa,萃取温度为45℃,萃取时间为1.5h。夹带剂用量这个因素对萃取过程的影响不完全一致,但从灵芝总三萜含量和灵芝酸B含量为主要考察指标的角度考虑,以选择夹带剂用量为3mL・g。1为佳,最终确定最佳萃取工艺:萃取压力为25MPa,萃取温度为45℃,萃取时间为1.5h,夹带剂用量为3mL・g~。2.7验证试验为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性,取3份药材,每份100g,按上述最佳萃取条件进行试验,结果见下表5。表5工艺验证试验rag・g“3讨论本试验通过正交试验法对超临界CO:萃取灵芝子实体中三萜类成分的萃取条件进行了优化,综合灵芝总三萜含量、灵芝酸B含量、灵芝固形物含量等3项指标进行考察,确定最佳萃取工艺为A:B:c2第33卷第17期2008年9月中国中药杂志ChinaJournalofChineseV01.33.I舢17September,2008MateriaMedica珐。将最佳工艺进行验证试验,证明该最佳萃取工艺稳定、可靠。后,超临界CO:流体的挥发性和扩散性提高,促进灵芝三萜溶出到超临界CO:流体中,萃取量增多;二是随着温度的升高,CO:流体的密度降低,导致cO:流体的溶剂化效应下降,使灵芝三萜在其中的溶解以可见分光光度法测定灵芝总三萜含量是以三萜类成分熊果酸为对照品,而在灵芝三萜中并不含有熊果酸,所以可见分光光度法只能粗略的测定灵芝三度下降。因此,在本试验条件下选择灵芝三萜的最佳萃取温度为45℃。夹带剂的使用有利于增加超临界cO:对极性物质的溶解能力和选择性,在本试验条件下夹带剂的最佳用量选择3[参考文献]£1】中国药典.一部[S].2005:t30.[2]LakshmiB,AjithTA,NayarmJose,eta1.Antimutsgenicactivityofmethanolicice口tt_ract萜的含量。灵芝酸B是灵芝中一种重要的三萜类成分,具有很强的药理活性,作者以RP.HPLC测定灵芝酸B的含量,比可见分光光度法测定灵芝总三萜的含量更可靠、准确,而且可以进一步验证可见分光光度mL・g~。法测得的试验结果。所以本试验综合考察灵芝总三萜的含量和灵芝酸B的含量试验结果更为可靠。萃取压力是超临界流体萃取过程中的关键因素之一,萃取压力增加则超临界流体的密度增大,从而增强其溶解能力,提高萃取率。但从结果分析可知,ofGanodermaluc/dumanditseffectonhepat-damagecausedbybenzo【a]pymne【J].JEthnopharmacol,2006(107):297.[3]蔺丽,方能虎,吴旦.灵芝有效成分的研究概况[J].中成药,2002,24(to):793.[4】马林,吴丰,陈若芸.灵芝三萜成分分析[J].药学学报,2003,38(1):50.[5]许海燕,侯敏娜,刘剑.灵芝总三萜提取工艺研究[J].陕西中医学院学报。2007,30(3):43,[6]陈体强,吴锦忠.超微粉碎后超临界C02萃取灵芝孢子挥发油组分的GC—MS分析[J].天然产物研究与开发,2006,18:982.[7]王杉,周科勤,范青生,等.超临界C02萃取菌草灵芝孢子油中三萜类物质和脂肪酸的测定[J].食品与机械,2006,22(1):74.萃取压力与灵芝三萜的萃取量并不成线性关系,当压力增大到25MPa以后,灵芝三萜的萃取量增加不明显。这是因为压力增大到一定程度后,大部分灵芝三萜成分被释放溶出到超临界流体中,再增大压力,已失去意义,同时萃取压力增加会导致高压设备的安全性隐患增大,因此萃取压力选择25MPa为宜。温度是除压力之外的另一个重要的影响因素。本试验中,温度对灵芝三萜萃取的影响有两种趋势:随着温度的升高,萃取量逐渐增加,当超过45℃时,又逐渐下降。这是由于温度对灵芝三萜在超临界[8]江绍琳,江绍玫,曾令聪.分光光度法快速测定灵芝中总三萜含量[J].江西农业大学学报,2006,28(4):634.CO:流体中的溶解有两方面的影响:一是温度升高ExtractionoftriterpenoidsfromfruitsofGanodermalucidumbysupercriticalfluidextractionSONGShi.hual”,JIAXiao.binl,CHENYahl”,CHENBinl,WANGLi-jing,ZHAOCenterforCheng—leil(1.JiangsuProvincialAcademyofChineseMedicine,JiangsuEngineeringResearchPharmaceuticalPreparation,Nanjing210028,China;2.DepartmemofPharmaceutics,JiangsuUniversity,zk啦诬唔212013。China)lnc/dumbysupercriti-[Abstract]Objective:TocaloptimizetheextractingconditionforlriterpenoidsfromthefruitsofGanodermawerefluidextraction(SFE).Method:OptimumextractionconditionsWS.Sstudiedbyorthogonaltests.Thetotaltriterpenoidswe地de-condl・byRP・HPLC.Result:TheoptimalextractionwasterminedbyultravioletspectrophotometryandganodericacidBtionsweredeterminedthatthepressure25MPa,thetemperatureatWaS45℃,theextractiontime1.5hour。andthetoextractethanolwasemployed88modifiercarrierdermalucidum.thevolumeof3mL・g一.Conclusion:SFEissuperioranditisfeasibletriterpenoidsfromfruitsofGano-[Keywords]acidB:RP-HPI』:Gctnoderm嘧luc/dum;supercriticalfluidextraction;orthogonalexperimentaldesign;totaltriterpenoids;ganoderic[责任编辑鲍雷】・2107・万方数据 

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