注射用油细菌内毒素检查方法的研究

注射用油细菌内毒素检查方法的研究

【关键词】 ,注射用油

摘 要 注射用油为非水性液体，无法直接利用鲎试剂进行细菌内毒素检查。本方法利用细菌内毒素可溶于水的特性对注射用油用水提取作前处理后，使之适用于凝胶反应。结果表明：通过干扰试验、阳性对照和阴性对照试验，证实应用鲎试剂作注射用油的细菌内毒素检查是可行的，而且具有灵敏、准确、快速的优点。

关键词 注射用油；细菌内毒素；干扰试验；鲎试剂。

注射用油是静脉脂肪乳注射液的主要原料之一，在制剂中的用量达10%~30%。目前，国内外脂肪乳剂作为静脉滴注的大容量注射液，其质量标准中已增加细菌内毒素检查项目［1］。鉴于注射用油的毛油来源较复杂，在精制过程中反复使用过除臭剂、脱色剂、吸附剂和助滤剂等,精制步骤繁多复杂，工艺周期长，比较容易被污染，而且油脂类物质本身容易被氧化酸败，使用的容器设备、管道装置不易进行清洗消毒，因而特别容易滋长微生物，成为工艺卫生控制的难点。因此，对注射用油进行细菌内毒素的检查和控制是十分必要的，是确保脂肪乳注射液质量重要的和关键的有效措施。

1 实验仪器与材料

1. 1 实验仪器

垂直流层超净工作台（SYT-JH-12型 深圳美加净化设备厂），小型离心机（上海化学仪器厂），电热恒温水浴箱（HW2-型 北京医疗设备厂），漩涡混合器（XK96-A型 江苏新

康仪器厂），经240℃ 2 h除内毒素处理的玻璃仪器及内毒素检验专用器具。

1.2 实验试药

供试样品（S）:注射用油、辽宁北亚药用油公司(批号 001027、010209)，广州第十制药厂(批号 001116、010523)。

1. 3 实验试剂

鲎试剂（TAL）： 广东湛江安度斯生物有限公司，批号 010326 ，灵敏度 0.125Eu/mL； 广东湛江海洋生物制品厂，批号 010515，灵敏度 0.125Eu/mL。

内毒素工作标准品（CSE）: 中国药品生物制品检验所，批号 00-02 10 Eu/mL。

细菌内毒素检查用水（BET）: 广东湛江安度斯生物有限公司，批号 010316 100 mL/瓶;内毒素含量<0.015 Eu/mL。

2 实验方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验

按照中国药典2000版细菌内毒素检查方法的规定，复核试验用TAL灵敏度。取λ=0.125 Eu/mL的TAL,将细菌内毒素工作标准品用BET检查用水溶解，在漩涡混合器上处理15 min，然后制成合适的稀释度，即2λ，λ，0.5λ，0.25λ备用。按检查法项下试验，计算TAL反应灵敏度测定值（λc），结果见表1。

λc=lg-1(∑x/4)

当λc在0.5~2 λ（包括0.5 λ和2 λ）时，方可用于细菌内毒素检验

2.2 供试品干扰试验

本试验为测试并确认稀释后样品溶液中，超过最大有效稀释倍数之内不含内毒素。分别用BET检查用水和1∶10样品液稀释内毒素工作标准品，使每管含内毒素分别为0.25~2 λ，即0.25 Eu/mL，0.125 Eu/mL，0.06 Eu/mL，0.03 Eu/mL，每个浓度为4管，并同时有阴性对照，于每管均加入同样量的TAL 0.1 mL(0.125 Eu/mL)，在（37±1）℃反应60 min。根据每管阳性反应结果，按照公式λ=log-1（∑logχ[]n）,计算反应终点浓度的几何平均值，判断样品在该浓度下是否有增强和抑制作用。

表1 TAL灵敏度复核试验TAL批号 （略）

2.3 判断结果

用BET检查用水稀释内毒素标准品(λ应在0.5~2之间)，表明所用鲎试剂灵敏度等符合规定，因而确认本试验有效。

用1∶10样品液稀释内毒素标准品，λt应在0.5~2λt,因而确认本实验无抑制作用。

当λt<0.5λ，表明此浓度的样品溶液对TAL试验有增强作用，为λt>2λ,表明此浓度的样品溶液对TAL试验有抑制作用。

2.4 干扰试验结果

分别采用辽宁北亚注射用油和广州十厂注射用油，用BET检查用水作提取处理稀释10倍后进行干扰试验，结果见表2~5。

结果表明本试验有效、无增强和抑制作用，不存在干扰。

结论：通过对两个来源注射用油检测，表明样品经提取处理稀释10倍后用λ=0.125 Eu/mL的TAL和0.25 Eu/mL内毒素工作标准品试验无增强和抑制作用，鲎试剂法可用于样品测定，不产生干扰影响。

表2－表5 （略）

2.5.1 供试液的制备

取0.5 mL注射用油于试管中，加入5 mL BET检查用水在漩涡混合器上混合5次，每次30 s，然后用离心机在2500 r/min下分离处理10 min，水层为含1∶10样品稀释液，取0.1 mL用于内毒素试验。［2］另取05 mL去除内毒素的注射用油于试管中，先加入1 mL内毒素液（1.25 Eu/mL）在漩涡混合器上混合5次，每次30 s，再加入BET检查用水4 mL，如上法混合均匀，然后用离心机在2500 r/min下分离10 min，取水层01 mL用于作供试品阳性对照（二管），检出样品内毒素限值为2.5 Eu/mL。

2．5．2 检测操作程序与结果判断［3］

按中国药典(2000二部)附录Ⅺ E细菌内毒素检查项下依法操作分别制备阳性对照、阴性对照、供试品阳性对照和供试品各管，以及依法对测定结果进行判断。检测结果见表6。

表6－表7 （略）

4 讨论

41 鉴于脂肪乳注射液法定标准已采用内毒素检验的前提下，对脂肪乳的生产原料进行内毒素控制是十分必要的。

42 由于生产乳剂的设备、装置、管道、器具等条件复杂，油脂类残留物清洗困难大的原因，清洗效果的验证难以用化学指标评价。因此，工艺清洗验证用TAL检测有实用的意义。

43 致热物质检查采用家兔法与TAL法相关性显著，吻合率高，而操作又简单便捷，准确度较高，重现性好，干扰少。

44 细菌内毒素在水中能溶解，用水可将注射用油中的内毒素提取，水层作为供试液用以测定内毒素。可靠确切，反复实验证明供试品阳性对照为正反应。

45 实验结果表明：本文提出的操作方法用于测定注射用油中的内毒素限量，无干扰作用,方法可行。