乳酸脱氢酶法操作说明

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总

(LDH法细胞毒性检测：

原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率 LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。

乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。该实验方法操作简便、快速，可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。

同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组 按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）

细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶

操作流程：

设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基

实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞 设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基

设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×） 设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×） 设立背景对照组：100μl培养基 250g离心4分钟 37℃孵育4小时

离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组 250g离心4分钟

取上清50μl转移至另一孔板

（可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000） 于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物 室温避光孵育30分钟 添加50μl终止溶液 490nm测吸收值

1. 靶细胞接种数目的优化 1.1. 设立检测板

1.1.1. 准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析

相同的培养基及孔板终体积。例如，若以50μl/孔的靶细胞及50μl/孔的效应细胞接种，则以100μl/孔梯度稀释。 1.1.2. 设置不含细胞的背景对照组

1.1.3. 可选:验证LDH阳性对照。使用涡旋混匀器轻轻混匀LDH阳性对照液，以1：

5000稀释（稀释方法：取2μl原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用与实验孔相同的体积。

1.2. 细胞裂解及收获上清

1.2.1. 裂解细胞 每100μl培养基加10μl裂解溶液（10×） 1.2.2. 37℃，5%CO2孵育45分钟 1.2.3. 250g离心4分钟 . LDH检测

1.3.1. 转移50μl上清至另一孔板

1.3.2. 解冻检测缓冲液，取12ml（避光），将剩余的迅速冻存（可以使用37℃水浴解冻，但不可放置过长时间）。将12ml检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个96孔板）中，倒置混匀。稀释后，避光、迅速添加。

1.3.3. 50μl/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃保存6-8周） 1.3.4. 添加50μl终止溶液

1.3.5. 将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490或492nm） 1.3.6. 至少检测两次吸收值

接种靶细胞（100μl/孔）至96孔板 加入裂解液（或冻存-解冻） 250g离心4分钟

取上清50μl转移至另一孔板 用检测缓冲液稀释底物混合物 添加底物混合物50μl/孔 室温避光孵育30分钟 添加50μl终止溶液 490nm测吸收值

2.细胞毒分析检测 . 设立检测板

2.1.1. 效应细胞自发释放组 设立不同浓度的效应细胞自发释放组，终体积与实验孔一致

2.1.2. 实验组 加入相同数目的靶细胞，按照不同效靶比加入效应细胞，补足培养基（最小体积：100μl/孔）。

2.1.3. 靶细胞自发释放组 加入最优化的靶细胞数，补足终体积 2.1.4. 靶细胞最大释放组 加入最优化的靶细胞数，补足终体积。

2.1.5. 体积校正对照组 100μl培养基中加入10μl的裂解液，用于校正由于加入裂解液而引起的体积变化（体积改变影响酚红及血清的含量）。

2.1.6. 背景对照组 用于校正培养基中由酚红及血清引起的LDH影响。

2.1.7. LDH阳性对照（可选） 使用涡旋混匀器轻轻混匀LDH阳性对照液，以1：5000稀释（稀释方法：取2μl原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用与实验孔相同的体积 2.1.8. 250g离心4分钟，以使效应细胞与靶细胞充分接触 . 细胞培养、收获上清

2.2.1. 37℃，5%CO2孵育检测板（效靶细胞接触的最短时间为4小时）

2.2.2. 靶细胞最大释放组中加入裂解液 每100μl培养基加10μl裂解溶液（10×）。该体系中Triton X-100的浓度为%，可使靶细胞完全裂解（收获上清前45分钟加入裂解溶液）。显微镜下观察细胞状态，若靶细胞未完全裂解，再补5μl 的裂解液。 2.2.3. 250g离心4分钟 . LDH检测

2.3.1. 转移50μl上清至另一孔板

2.3.2. 解冻检测缓冲液，取12ml（避光），将剩余的迅速冻存（可以使用37℃水浴解冻，但不可放置过长时间）。将12ml检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个96孔板）中，倒置混匀。稀释后，避光、迅速添加。

2.3.3. 50μl/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃保存6-8周） 2.3.4. 添加50μl终止溶液

2.3.5. 将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490或492nm） . 结果统计

2.4.1. 所有的实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值应减去背景平均吸收值

2.4.2. 靶细胞最大释放组的吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值 2.4.3. 校正后的值用于杀伤率的统计：

细胞杀伤率(%)= ［（实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）］×100%