miRNA145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2019.05.012

miRNA鄄145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响

祝摇磊摇李炳强摇陈摇晨摇(石河子大学医学院第一附属医院,石河子832000)

摇摇中图分类号摇R735郾3+5摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2019)05鄄0575鄄04

145拟似物、阻遏物和阴性对照物至HCT116细胞,采用荧光实时定量PCR法检测细胞内miRNA鄄145表达,采用MTT法检测细胞增殖活性,采用Transwell小室法检测HCT116细胞侵袭,采用AnnexinV鄄FITC/PI双染法检测转染后HCT116细胞凋亡情况。结果:转染后24h、48h、72h时拟似物转染组细胞增殖活性显著低于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组(P<0郾05),空白对照组和阴性对照组细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0郾05),阻遏物转染组细胞增殖活性显著高于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组(P<0郾05)。转染24h、48h、72h时拟似物转染组miRNA鄄145表达显著高于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组,阻遏物转染组miRNA鄄145表达显著低于拟似物转染组、空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P<0郾05);空白对照组和阴性对照组miRNA鄄145表达水平差异均无统计学意义(P>0郾05)。Transwell小室法检测结果显示,拟似物转染组穿膜细胞数显著少于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组,阻遏物转染组穿膜细胞数显著多于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组,差异均有统计学意义(P<0郾05);空白对照组和阴性对照组穿膜细胞数相比较差异均无统计学意义(P>0郾05)。AnnexinV鄄FITC/PI双染法检查结果显示,拟似物转染组细胞凋亡率显著高于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组,阻遏物转染组细胞凋亡率显著低于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组,差异均有统计学意义(P<0郾05);空白对照组和阴性对照组细胞凋亡率相比较差异无统计学意义(P>0郾05)。结论:miRNA鄄145表达异常是影响HCT116细胞增殖、侵袭、凋亡重要因素,为新的基因靶点的药物开发提供了思路。

[关键词]摇结肠癌;HCT116细胞;miRNA鄄145;增殖活性;侵袭活性;细胞凋亡

[摘摇要]摇目的:探讨miRNA鄄145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法转染miRNA鄄

EffectofmiRNA鄄145onproliferation,invasionandapoptosisofcolorectalcancercellsinvitro

832000,China

ZHULei,LIBing鄄Qiang,CHENChen郾FirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege,Shihezi

[Abstract]摇Objective:TostudytheeffectofmiRNA鄄145ontheproliferation,invasionandapoptosisofcolorectalcancercellsin

vitro郾Methods:ThemiRNA鄄145mimetic,repressorandnegativecontrolsubstanceweretransfectedintoHCT116cellsbyliposometransfection郾TheexpressionofmiRNA鄄145incellswasdetectedbyreal鄄timefluorescencequantitativePCR郾TheproliferativeactivityofcellswasdetectedbyMTTassay郾TheinvasionofHCT116cellswasdetectedbyTranswellmigrationassay,andtheapoptosisofHCT116cellswasdetectedbyAnnexinV鄄FITC/PIdoublestaining郾Results:At24h,48hand72haftertransfection,cellproliferationactivitygroup(P<0郾05)郾Therewasnosignificantdifferenceinproliferativeactivitybetweenblankcontrolgroupandnegativecontrolgroup(P>

inmimetictransfectiongroupwassignificantlylowerthanthatinblankcontrolgroup,negativecontrolgroupandrepressortransfection0郾05),andrepressortransfectiongrouphadsignificantlyhigherproliferativeactivitythanblankcontrolgroup,negativecontrolgroupandrepressortransfectiongroup(P<0郾05)郾TheexpressionofmiRNA鄄145inmimetictransfectiongroupwassignificantlyhigherthanthatinblankcontrolgroup,negativecontrolgroupandrepressortransfectiongroup,andtheexpressionofmiRNA鄄145inrepressortransfectiongroupwassignificantlylowerthanthatinmimetictransfectiongroup,blankcontrolgroupandnegativecontrolgroup,theandnegativecontrolgroup(P<0郾05)郾ThedetectionresultsofTranswellmigrationmethodshowedthatthenumberoftransmembranecellsofthemimetictransfectiongroupwassignificantlylessthanthatinblankcontrolgroup,negativecontrolgroupandrepressorinthenumberofmembranecellsbetweentheblankcontrolgroupandthenegativecontrolgroup(P>0郾05)郾TheAnnexinV鄄FITC/PItransfectiongroup,thenumberoftransmembranecellswasmoreinrepressortransfectiongroupthaninblankcontrolgroup,negativecontrolgroupandmimetictransfectiongroup,thedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0郾05)郾Therewasnosignificantdifferencedoublestainingshowedthattheapoptosisrateinmimetictransfectiongroupwassignificantlyhigherthanthatofblankcontrolgroup,negativecontrolgroupandrepressortransfectiongroup郾Theapoptosisrateinrepressortransfectiongroupwassignificantlylowerin

作者简介:祝摇磊,男,硕士,主治医师,主要从事胃肠乳腺方面的研究,E鄄mail:zyzlygm002@163郾com。

differencewasstatisticallysignificant(P<0郾05),buttherewasnosignificantdifferenceinexpressionlevelbetweenblankcontrolgroup

·576·中国免疫学杂志2019年第35卷

blankcontrolgroup,negativecontrolgroupandmimetictransfectiongroup,thedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0郾05)郾Therewasnosignificantdifferenceincellapoptosisratebetweenblankcontrolgroupandnegativecontrolgroup(P>0郾05)郾Conclusion:TheabnormalexpressionofmiRNA鄄145isanimportantfactorintheproliferation,invasionandapoptosisofHCT116cells,whichprovidesawayforthedevelopmentofnewgenesasatargetforthedevelopmentofdrugs郾

[Keywords]摇ColonCancer;HCT116Cells;miRNA鄄145;ProliferationActivity;Invasion

摇摇结肠癌发病率和死亡率分别占全身恶性肿瘤的60万死亡病例,严重威胁患者的生命安全和生活质量[1]。结肠癌的临床治疗方案主要为手术切除为主联合放疗、化疗的综合疗法,因结肠癌早期缺乏特异第3位和第4位,全球每年有120万新发病例,超过

度培养于37益、5%CO2细胞培养箱中,隔天更换培1郾2郾2摇细胞转染摇取对数生长期的HCT116细胞,胰酶消化后1000伊g离心2min,收集细胞,调整细胞密度至1伊105ml-1,接种至6孔细胞培养板,每孔添养液。

性表现,多数患者诊断时已处于中晚期,化疗是主要治疗方式,5年生存率不足40%,复发和转移是影响疗效的主要因素[2]结肠癌治疗效果成为临床研究的热点。寻找新的治疗方法和策略,基因治疗是癌,改善症治疗的新理念,明确影响结肠癌发病和进展的生物学、基因学特点可为基因学治疗和预后改善提供新证据[3]子。miRNA鄄145是位于人染色体5q32鄄33的小分miRNA鄄145RNA,卵巢癌生长等作用表达、,miRNA鄄145,前列腺癌它具有阻止细胞癌变和抑制癌细胞、食管癌等癌旁组织均可见表达的变化对肿瘤的发生、增殖、侵袭、凋亡等均有一定影响,但在结肠癌中的研究较少[4鄄5]拟似miRNA鄄145物和阻。本研究将人工化学合成的遏物转染结肠miRNA鄄145的影响,现将结果报告如下对结肠癌HCT116癌。

细胞增殖HCT116、细侵袭胞,、探凋亡讨1摇材料与方法

1郾1摇材料

1郾1郾1摇细胞株摇结肠癌细胞株HCT116购自中国科学院细胞库。

1郾1郾2摇主要试剂及仪器摇胎牛血清、0郾25%胰蛋白2000酶购自武汉普诺赛生命科技有限公司;Lipofectamine昊佳生物科技有限公司转染试剂、Trizol和反转录试剂盒购自武汉科公司;MTT、Transwell;RT鄄PCR小室购自北京优尼康生

试剂盒购自日本物科技有限公司Takara。

细胞培养箱购自长沙华曦电子科技有限公司;分光光度计、酶标仪、PCR仪购自美国HACH公司;化学法合成miRNA鄄145拟似物、阻遏物和阴性对照物、miRNA拟似物、阻遏物、阴性对照物合成、测序均由大连宝公司进行。1郾2摇方法

1郾2郾1摇细胞培养摇细胞株复苏后,用含10%胎牛血清的RMPI10培养液将细胞以1伊106ml-1的密加2ml细胞悬液,37益和5%CO24h,共分为4组,即空白对照组(Blank2条件下培养controlgroup,BC组group,)只NC转染组试)剂,阴性对照组(NegativecontrolmiRNA145拟似转物染转染miRNA145组(Mimetic阴性transfection对照物,group,MT遏物转染组组()Repressor转染miRNA145transfection拟似物group,RT,miRNA145组)阻转2000染miRNA145说明进行阻遏物。

,转染过程按照Lipofectamine1郾2郾3摇HCT116增殖活性检测摇转染后48h,胰酶消化法制备HCT116细胞悬液转移至每孔含1伊1096孔板中,调整细胞密度1伊105ml-1,4个,每组设6个复MTT,孔溶解沉淀继续培养,接种后,震动混匀沉淀424h后h、48,弃上清液h、72h每孔加入20滋l

15min,,加入酶标仪比色100滋lDMSO490nm处吸光度值。,记录

1郾MTT2郾4摇

检测同时间点取细胞样本转染后细胞内miRNA鄄145,采用6表孔板接种密度

达检测摇与

2伊105个/孔,酚氟仿法抽取RNA,取2滋g总RNA,反转录制备cDNA,取2滋l反转录产物作为PCR反应模板,荧光定量法检测miRNA鄄145含量,反应条件:95益变性10s,58益退火10s,72益延伸10s,循环数设置为CCGAGCTCTGGCTC鄄3忆,40。引物序列:miRNA鄄145:CCAGGAATCCCT鄄3忆;GCTCGCTTCGGCAGCACAT鄄3忆,内参下(游上游RTU6:5忆鄄GTCCAGTTTTC鄄:5忆鄄GCCGGCGC鄄GCGAAGTGCTTAAAC鄄3忆。2-驻驻Ct法分析定量结果下):游:上5忆鄄TACCTT鄄游:5忆鄄GT鄄。

1郾2郾5摇Transwell小室法检测HCT116细胞侵袭摇取转染后HCT116细胞1伊105上室ml-1,RMPI10,每孔室细胞数,培养基加入下室160滋l,加入20%接种于Transwell板采用在400伊显微镜下随机选取和上

,培养ASPS24血清h,计数基底膜下40滋l,800滋l下左右5个视野的穿越基底膜细胞数,取均值。

1郾2郾6摇

AnnexinV鄄FITC/PI双染法检测转染后

祝摇磊等摇miRNA鄄145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响摇第5期·577·

HCT116细胞凋亡情况摇转染72h后HCT116细胞以0郾25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集,用PBS洗涤细胞2次,加入500滋lBindingBuffer悬浮,再加入5滋lAnnexinV鄄FITC混匀,最后加入5滋lPI混匀,室温避光反应10min后,采用流式细胞仪检测1郾3摇统计学方法摇采用SPSS23郾0进行统计学数据处理。计量资料采用x依s表示,组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD鄄t法,P<0郾05为差异有显著性。各组的细胞凋亡情况。

染组miRNA鄄145表达显著高于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组,阻遏物转染组miRNA鄄145表达显著低于拟似物转染组、空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义(P<0郾05);空白对照组和阴性对照组miRNA鄄145表达水平差异均无统计学2郾3摇HCT116细胞侵袭能力比较摇Transwell小室法检测结果显示,拟似物转染组穿膜细胞数显著少于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组,阻遏物转染组穿膜细胞数显著多于空白对照组、阴性对照意义(P>0郾05)。见图2。

2摇结果

2郾1摇HCT116增殖活性比较摇细胞活性检测结果显示,转染后24h、48h、72h时拟似物转染组细胞增殖活性显著低于空白对照组、阴性对照组和阻遏物转染组(P<0郾05),空白对照组和阴性对照组细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0郾05),阻遏物转染组细胞增殖活性显著高于空白对照组、阴性对照组2郾和拟似物转染组2摇

HCT116细(P胞<0郾内05)。miRNA鄄145见图1。

表达摇RT鄄PCR

结果显示,转染24h、48h、72h时拟似物转

图1摇HCT116增殖活性比较

Fig.1摇ComparisonofHCT116proliferationactivity

Note:Compared#郾P<0郾05郾

withMTgroup,*郾P<0郾05;comparedwithRTgroup,

图2摇HCT116细胞内miRNA鄄145表达

Fig.2摇ExpressionofmiRNA鄄145inHCT116cells

Note:Compared#郾P<0郾05郾

withMTgroup,*郾P<0郾05;comparedwithRTgroup,

组和0郾05);拟空白对照组和阴性对照组穿膜细胞数相比似物转染组,差异均有统计学意义(P<较差异均无统计学意义2郾(P>0郾05)。见图3。FITC4摇HCT116细胞凋亡水平相比较摇AnnexinV鄄凋亡率显著高于空白对照组/PI双染法检测结果显示、阴性对照组和阻遏物,拟似物转染组细胞转染组,阻遏物转染组细胞凋亡率显著低于空白对照组、阴性对照组和拟似物转染组,差异均有统计学意义(P<0郾05);空白对照组和阴性对照组细胞凋亡率相比较差异无统计学意义(P>0郾05)。见图4。图3摇HCT116细胞侵袭能力比较

Fig.3摇ComparisonoftheinvasivenessofHCT116cells

Note:Compared#郾P<0郾05郾

withMTgroup,*郾P<0郾05;comparedwithRTgroup,

图4摇HCT116细胞凋亡水平相比较

Fig.4摇ComparisonofHCT116cellapoptosislevel

Note:Compared#郾P<0郾05郾

withMTgroup,*郾P<0郾05;comparedwithRTgroup,

·578·中国免疫学杂志2019年第35卷

[3]摇连建安,姜斌骅,傅永清郾结肠癌细胞OPN和HIF鄄1琢基因表

达水平与结肠癌恶性生物学行为的关系[J].中国卫生检验杂志,2017,27(21):3140鄄3141,3144郾

LianJN,JiangBH,FuYQ郾TherelationshipbetweenthegeneexpressionlevelofOPNandHIF鄄1alphaincoloncancercellsandthemalignantbiologicalbehaviorofcoloncancer[J].ChinJHealthLabTechnol,2017,27(21):3140鄄3141,3144郾

[4]摇银摇瑞,董新伟,王摇铮,等郾肺腺癌相关微小RNA的筛选及

其功能研究[J].中华实验外科杂志,2016,33(1):115鄄117郾YinR,DongXW,WangZ,etal.ScreeningandfunctionalstudyofsmallRNAassociatedwithlungadenocarcinoma[J].ChinJExpSurg,2016,33(1):115鄄117郾

[5]摇郭摇莹,瞿摇文,王一浩,等郾microRNA在自身免疫性疾病中

的研究进展[J].中国免疫学杂志,2016,32(8):1237鄄1240,1244郾

GuoY,QuW,WangYH,etal.microRNAresearchprogressinau鄄3摇讨论

结肠癌的发生和发展是多步骤、多因素的进行性过程,详细机制尚未完全阐明,探讨其发病机制有助于对其有更深入的了解,并有助于指导临床治疗。miRNA为高保守、高组织特异性且无蛋白编码的小分子RNA,是转录后水平基因表达的关键因子,调节着人类三分之一的基因,参与诸多生理病理过程,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[6]。miRNA鄄145长度约4郾08kb,可通过IRS鄄1、IGF鄄IR、C鄄myc、RTKN、ERBB、BNIP3、YES、STAT1、EGFR、MUC鄄1化、侵袭、凋亡等过程等靶基因影响肿瘤细胞[7]的生长、分近年来的研究显示,miRNA鄄145。

在前列腺癌、胃癌、喉癌、肾癌、宫颈癌、非小细胞肺癌等肿瘤中均表现为水平下调,提示正常机体中miRNA鄄145可能抑制原癌基因激活,miRNA鄄145功能受到抑制可能是原癌基因激活的重要原因[8鄄13]。等[14]研究显示,miR鄄145与Sp1在肺腺癌A9细胞中表达呈显著相关性,miR鄄145异常表达可能是Sp1基因表达的关键原因,miR鄄145可能通过对Sp1表达的影响A9细胞生物学行为。赵一奇等[15]研究认为,miR鄄145可下调肿瘤转移基因Mucl,沉默Mucl表达,肿瘤生长和抑制肿瘤转移,可能是临床肿瘤治疗的潜在手段。

本研究通过脂质体转染法转染miRNA鄄145拟似物和阻遏物至HCT116细胞,RT鄄PCR检测显示拟似物转染组HCT116细胞miRNA鄄145表达较空白对照组HCT116和阴性对对照HCT116组显细胞照组显著升高,而阻遏物转染组著降miRNA鄄145低。抑制表达较空白对照组和阴性miRNA鄄145表达则增强增强miRNA鄄145细胞增殖表达则可降低、侵袭活性、降低肿瘤细胞凋亡HCT116细胞增殖,、侵袭活性和增加肿瘤细胞凋亡。这些实验结果和数据提示,miRNA鄄145表达异常是影响HCT116细胞增殖、侵袭、凋亡重要因素,这为新的基因靶点的药物开发提供了思路。

参考文献:

[1]摇黄胞摇雪,郑媛媛,李富荣Huang[J].郾免疫细胞靶向治疗结肠癌肿瘤干细

forcolonX,中国免疫学杂志,2017,33(1):156鄄160郾

cancerZhengstemYY,LicellsFR郾[J].ImmunologicalChinJcelltargetedtherapy[2]摇156鄄160郾

Immunol,2017,33(1):刘表达摇娜2017,48(3):251鄄255郾

抑,制李结肠,癌高成伟LoVo郾细冬凌草甲素通过下调胞增殖[J].山西医NF鄄资B科大学/COX鄄2

学报,LiucancerN,LiWQ,GaoCW郾Oridonininhibitstheproliferationexpression[J].LoVocellsJShanxibydown鄄regulationMedUniv,2017,48(3):251鄄255郾

ofNF鄄kappaBof/COX鄄2colontoimmunediseases[J].ChinJImmunol,2016,32[6]摇1240,1244郾

(8):1237鄄XufragmentationQ,LiuLZ,Qianfactor鄄45(DEF鄄45)鄄mediatedX,etal.miR鄄145,anewapoptoticregulatoroftheDNA

[7]摇Molnetwork[J].YanCancer,2010,9(2):11鄄16郾

synergisticallyX,ChenregulateX,LiangERBB3H,toetsuppressal.miR鄄143andmiR鄄145

[8]摇invasion郭inbreastcancer[J].MolCancer,2014,24(13):220郾cellproliferationand及临床意义摇斌,郭摇枫,郭永连,等郾GuoofMiRNA鄄145B,Guo[J].F,Guo中国老年学杂志miRNA鄄145在前列腺癌中的表达

inprostateYL,etal,2017,37(19):4824鄄4825郾cancer[.ExpressionJ].ChinandJclinicalGerontol,2017,37significance[9]摇(19):4824鄄4825郾

邢晓芳研究,李子禹郾miR鄄143和miR鄄145在胃癌中的表达及功能

Xing[J].ingastricXF,Li中华胃肠外科杂志cancerZY郾Expression,2015,18(1):50鄄53郾

[andfunctionofmiR鄄143andmiR鄄145[10]摇50鄄53郾

J].ChinJGastrointestSurg,2015,18(1):张定富意义Zhang[J].,吴秋芳,戈长征郾miRNA鄄145在喉癌中的表达及临床

miRNA鄄145DF,Wu中国临床研究inQF,GelaryngealCZ郾,2017,30(1):48鄄50郾

carcinoma[ExpressionJ].andChinclinicalJClinsignificanceRes,2017,of[11]摇30(1):48鄄50郾

Dobersteintargets[12]摇cell喻金梅carcinomatheK,SteinmeyermetalloproteaseN,HartemtzAK,etal.MicroRNA鄄145

patients[J].ADAM17Neoplasia,2013,15(2):218鄄230郾

andissuppressedinrenal达意义,YudifferentJM,An[J].安云婷,戴红春郾miRNA鄄145在不同宫颈组织中的表

cervixYT,Dai实用癌症杂志tissues[J].HC郾Significance,2016,31(11):1747鄄1748,1753郾PractJofmiRNA鄄145expressionin[13]摇1748,1753郾

Cancer,2016,31(11):1747鄄强勇的表达和意义,杨楠,张雷Qiang[J].,等医学研究生学报郾非小细胞肺癌患者血清中miRNA鄄145

miRNA鄄145Y,YanginN,ZhangserumofpatientsL,etal.withExpression,2016,29(1):62鄄65郾

non鄄smallandcellsignificancelungcancerof[14]摇[J].王[J].摇J丹Med郾miRNA鄄145Postgrad,2016,29(1):62鄄65郾

Wang江苏大学学报抑制肺癌A9细胞增殖活性的机制

cellsinD郾lungMiRNA鄄145(医学版),2015,25(4):311鄄316郾

cancer[J].inhibitsJJiangsutheproliferationUniv(activityofA9[15]摇(4):311鄄316郾

MedEdi),2015,25赵一奇现代肿瘤医学,焦摇峰,闵摇波,等郾贲门癌miRNA鄄145的表达[J].

ZhaocardiaYQ,Jiaocancer[J].F,Min,2016,24(6):1鄄3郾

JModB,etOncol,2016,24(6):1鄄3郾

al.TheexpressionofmiRNA鄄145in[收稿2018鄄05鄄09摇修回(编辑2018鄄06鄄28]

摇张晓舟)