(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109971660 A(43)申请公布日 2019.07.05
(21)申请号 201711464621.5(22)申请日 2017.12.28
(71)申请人 上海医药工业研究院
地址 200040 上海市静安区北京西路1320
号
申请人 中国医药工业研究总院(72)发明人 谢丽萍 胡又佳 冀柳欣 韩姝
龚桂花 张伟 潘洁 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283
代理人 薛琦 朱水平(51)Int.Cl.
C12N 1/15(2006.01)C12N 15/53(2006.01)C12N 15/80(2006.01)C12N 9/02(2006.01)
(54)发明名称
一种头孢菌素C的制备方法及其所用的基因工程菌(57)摘要
本发明公开了一种生产头孢菌素C的基因工程菌，所述基因工程菌为过表达琥珀酸半醛脱氢酶基因(SSADH)的顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。还公开了基因工程菌的制备方法，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的SSADH基因，以及包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的
公开了一SSADH基因的表达载体的pJS581质粒。
种头孢菌素C的制备方法，其步骤包括将上述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得头孢菌素C。还公开了所述基因工程菌在制备头孢菌素C中的用途。本发明通过在顶头孢霉CPC高产菌株体内导入SSADH的表达载体实现了SSADH表达量的提高，同时也实现了CPC产量的提高。
C12P 35/06(2006.01)C12R 1/645(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页序列表4页 附图3页
CN 109971660 ACN 109971660 A
权 利 要 求 书
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1.一种生产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为过表达琥珀酸半醛脱氢酶基因的顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，其携带含有琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达载体，所述表达载体的骨架质粒优选pYG858。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述顶头孢霉菌为顶头孢霉菌菌株CPCC480085或CPCC480096；所述琥珀酸半醛脱氢酶基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：利用携带含有琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达载体转化顶头孢霉菌株。
6.一种基因，其特征在于，所述基因为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的琥珀酸半醛脱氢酶基因。
7.一种包含核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达载体；较佳地，所述表达载体的骨架为质粒pYG858，所述表达载体为pJS581质粒。
8.一种头孢菌素C的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1或2所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得头孢菌素C。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养包括以下步骤：将所述基因工程菌接种于种子培养基中，种子培养温度25～30℃，时间3～5天；将所得培养物转接至发酵培养基中，发酵培养温度20～25℃，时间4～10天；较佳地，所述转接其接种量为10％，所述百分比为质量百分比；更佳地，发酵培养温度25℃，时间7天。
10.如权利要求1～4任一项所述基因工程菌在制备头孢菌素C中的用途。
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说 明 书
一种头孢菌素C的制备方法及其所用的基因工程菌
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技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种头孢菌素C的制备方法及其所用的基因工程菌。
背景技术
[0002]头孢菌素C(cephalosporin C，即CPC)是在自然界中发现的第二种类型的β-内酰胺类抗生素，其抗菌作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，对人体安全无毒，因此获得了广泛的关注。头孢菌素C抗菌活性低，但通过改造可获得更有效的半合成头孢菌素，是各种半合成头孢菌素的起始原料。顶头孢霉是发酵产CPC的一类重要工业微生物。经过多年研究，CPC在顶头孢霉体内的生物合成途径已被阐述得较为清楚，其中涉及的所有合成基因都已克隆得到，且纯化获得了这些基因编码的大部分酶(参见文献Martin JF.Alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetases in beta-lactam producing organisms.From Abraham's discoveries to novel concepts of non-ribosomal peptide synthesis.J Antibiot(Tokyo),2000,53(10):008-1021)。研究发现，CPC生物合成途径中的基因为成簇排列，主要分为两部分，一是位于7号染色体上的早期基因簇：包括合成基因pcbAB、pcbC、cefD1以及cefD2；二是位于1号染色体上的晚期基因簇，由同一个双向启动子启动的合成基因cefEF和cefG组成(参见文献Gutierrez S,Fierro F,Casqueiro J,et al.Gene organization and plasticity of the beta-lactam genes in different filamentous fungi[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1999,75(1-2):81-94)。这些基因直接影响了顶头孢霉最终发酵产物中CPC的含量。
[0003]随着CPC生物合成主要途径的阐明，合成途径中的基因调控及其调控机制受到了许多研究者的关注。近年已发现在CPC生物合成过程中起重要作用的一些调控蛋白，如对CPC合成起正调控作用的CPCR1(请参见文献Schmitt EK,Kuck U.The fungal CPCR1protein,which binds specifically to beta-lactam biosynthesis genes,is related to human regulatory factor X transcription factors.J Biol Chem,2000,275(13):9348-9357)、AcFKH1(参见文献Schmitt EK,Hoff B,Kuck U.AcFKH1,a novel member of the forkhead family,associates with the RFX transcription factor CPCR1in the cephalosporin C-producing fungus Acremonium chrysogenum.Gene,2004,342(2):269-281)和PacC(参见文献Schmitt EK,Kempken R,Kuck U.Functional analysis of promoter sequences of cephalosporin C biosynthesis genes from Acremonium chrysogenum:specific DNA-protein interactions and characterization of the transcription factor PACC[J].Mol Genet Genomics,2001,265(3):508-518)，以及负调控子Cre1(参见文献Jekosch K,Kuck U.Glucose dependent transcriptional expression of the cre1gene in Acremonium chrysogenum strains showing different levels of cephalosporin C production[J].Curr Genet,2000,37(6):388-395)。与构巢曲霉veA基因同源的AcveA是近年来在顶头孢霉中发现的一个全局性调控子，
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其调控了pcbAB、pcbC、cefD1、cefD2、cefEF以及cefG全部6个主要的CPC生物合成基因的转录水平，敲除该基因会大幅度降低CPC的产量(参见文献Dreyer J,Eichhorn H,Friedlin E,et al.A homologue of the Aspergillus velvet gene regulates both cephalosporin C biosynthesis and hyphal fragmentation in Acremonium chrysogenum.Appl Environ Microbiol,2007,73(10):3412-3422)。[0004]到目前为止，顶头孢霉CPC生物合成途径的研究已经比较透彻，但其调控机制和初级代谢以及前体的生物合成途径对次级代谢生物合成的影响则尚不清楚，造成了目前顶头孢霉CPC产量不高的缺陷。
发明内容
[0005]本发明所要解决的技术问题是，针对目前存在的头孢菌素C产量不高的问题，提供了一种新的头孢菌素C的制备方法及其所用的基因工程菌。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一为，一种生产头孢菌素C的基因工程菌，其所述基因工程菌为过表达琥珀酸半醛脱氢酶基因的顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。
[0007]本方法从初级代谢途径分析入手，通过分析代谢途径推测SSADH基因(图1)对CPC合成有上调作用，并通过转录水平分析进行验证，最后通过过表达SSADH，证明了该基因的过表达确实可以提高CPC发酵单位。[0008]本发明中，过表达是指将目的基因的序列与高活性组成型启动子融合构建成质粒载体，通过转化，获得该基因产物大量积累的生物体。基因过表达的作用主要与基因本身编码蛋白的功能有关。一般来讲，过表达会导致该蛋白的含量增高，如果在细菌中过表达，有利于批量生产。
[0009]表达质粒pJS581的骨架质粒pYG858上分别含有原核筛选标记氨苄青霉素抗性基因(ampr)、真核筛选标记腐草霉素抗性基因(phleor)以及pcbAB-pcbC双向启动子，其中phleor位于活性较弱的pcbAB下游。其构建方法参考张丕燕等，顶头孢霉pcb AB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用[J]，微生物学报，2004，44(2):255-257。除pYG858外，其它具有相同元件的骨架质粒也可以用于构建和过表达SSADH。[0010]优选地，其携带含有琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达载体，所述表达载体的骨架质粒优选pYG858。
[0011]理论上所有顶头孢霉菌均可实现本发明，例如顶头孢霉菌CPCC420662、CPCC480073～9、CPCC480085、CPCC480095和CPCC480096。较佳地，所述顶头孢霉菌为顶头孢霉菌菌株CPCC480085或CPCC480096。所述琥珀酸半醛脱氢酶基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
[0012]优选地，所述琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。[0013]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一为，基因工程菌的制备方法，其包括以下步骤：利用携带含有琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达载体转化顶头孢霉菌株。[0014]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一为，一种基因，其为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的琥珀酸半醛脱氢酶基因。[0015]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一为，一种包含核苷酸序列如SEQ
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ID NO：2所示的琥珀酸半醛脱氢酶基因的表达载体；较佳地，所述表达载体的骨架为质粒pYG858，所述表达载体为pJS581质粒。[0016]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一为，一种头孢菌素C的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1或2所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得头孢菌素C。
[0017]较佳地，所述发酵培养包括以下步骤：将所述基因工程菌接种于种子培养基中，温度25～30℃，种子培养3～5天；将所得培养物转接至发酵培养基中，20～25℃，发酵培养5～10天。较佳地，所述转接其接种量为10％，所述百分比为质量百分比。更佳地，发酵培养温度25℃，时间7天。
[0018]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案之一为，所述基因工程菌在制备头孢菌素C中的用途。
[0019]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0020]本发明所用试剂和原料均市售可得。[0021]本发明的积极进步效果在于：本发明通过在顶头孢霉菌菌株体内导入琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)表达载体，实现了SSADH表达量的提高，同时也实现了CPC产量的提高。出发菌株CPCC480085的头孢菌素C产量为8.570mg/mL，过表达SSADH的顶头孢霉菌菌株CPCC480096头孢菌素C的产量为10.647mg/mL；过表达SSADH的顶头孢霉菌菌株CPCC480085头孢菌素C的产量为9.985mg/mL。
附图说明
[0022]图1为γ-氨基丁酸(GABA)支路和SSADH代谢途径分析，琥珀酸半醛脱氢酶SSADH是GABA途径的最后一个关键酶，琥珀酸半醛在SSADH作用后生成琥珀酸，直接回到TCA循环，并且产生大量的NADPH。
[0023]图2为高低产菌中SSADH基因转录水平分析，图中WT表示野生出发菌株，即低产菌；HY表示高产菌株，即过表达SSADH的菌株；“**”表示基因的转录水平之间具有统计学显著差异p<0.01。
[0024]图3为SSADH基因扩增结果。[0025]图4为SSADH基因序列比对。[0026]图5为SSADH氨基酸序列比对。
[0027]图6为顶头孢霉的发酵和发酵产物的HPLC检测，“*”表示基因的转录水平之间具有统计学显著差异p<0.05。
具体实施方式
[0028]菌株和质粒：[0029]大肠杆菌E.coli DH5α(购自上海唯地生物科技有限公司)；过表达的SSADH基因的菌株为顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)CPCC480085和CPCC480096，收藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心(ChinaPharmaceutical Culture Collection，CPCC)，购买自中国微生物资源网(北京普天同创生物科技有限公司)，资源平台号分别为1511C0004000004213
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和1511C0004000004224。质粒pYG858(质粒pYG858的构建方法请参考文献：张丕燕等，顶头孢霉pcb AB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用[J]，微生物学报，2004，44(2):255-257)。[0030]酶和试剂：
[0031]各种限制性内切酶、PrimeSTAR高保真酶、Mighty Mix连接酶、克隆用载体pMD19-T、DL2000DNA Marker、PrimeScript RT Reagent Kit、SYBRPremix Ex Taq等均购自Takara公司，UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、DNase I、RNase Inhibitor等购自生工生物工程(上海)有限公司，LysingEnzymes from Trichoderma harzianum购自Sigma，大量质粒抽提试剂盒购自MN公司。CPC标准品购买自国药威奇达药业有限公司。[0032]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0033]实施例1SSADH过表达质粒pJS581的构建[0034]基于对顶头孢霉RNA-Seq测序结果，找到编码SSADH的cDNA序列，设计引物并以RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增得到SSADH的基因序列。扩增模板为实验室保藏菌株顶头孢霉LD-7的基因组DNA，提取方法为：[0035](1)从斜面上刮下少量孢子，于盛有少量玻璃珠的研钵中充分研磨；[0036](2)研磨后用1mL抽提液溶解，转移至离心管中；[0037](3)加入等体积的酚氯仿，旋涡震荡3min，10000r/min离心5min；[0038](4)吸取上清至一个新的离心管中，加入等体积氯仿，10000r/min离心5min；[0039](5)吸取上清至一个新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置20min，12000r/min，离心10min；(可在离心管底部看到白色沉淀，即为基因组DNA)[0040](6)用70％乙醇洗涤一次，37℃干燥，加入1mL TE缓冲液(RNase)溶解，于37℃消化一段时间以去除RNA，-20℃保存。[0041]引物序列为：SSADH-EcoR I：GCGGAATTCATGGCGTCCTTCCCGCTGTCCCTGAGA(SEQ ID NO：3)和SSADH-Xba I：CCGTCTAGACTACTTGTCCAAGT TACCCAATGTT(SEQ ID NO：4)。[0042]PCR反应体系(25μL)为：PrimeSTAR Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，SSADH-EcoR I(10μM)1.0μL，SSADH-Xba I(10μM)1.0μL，ddH2O至总体积25μL。反应条件为：(1)98℃预变性10sec；(2)98℃10s，(3)64℃10s，(4)72℃10s；步骤(2)-(4)重复30个循环。[0043]将在甘油冷冻管中保存的质粒pYG858的DH5α宿主菌菌液接种于含有100g/ml Amp的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)试管中，37℃振荡培养过夜。吸取2ml菌液于Eppendorf离心管，离心弃上清(Eppendorf 5415R小型冷冻高速离心机，12,000×1min)，真空吸干残余液体，将沉淀重悬于100μL Solution I(葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH 8.0)，于漩涡混和器上振荡使菌体分散，冰浴10min。加入200μL Solution II(NaOH 0.2mol/L，SDS 1％，现用现配)，盖紧盖子后，颠倒管子数次，冰浴3～5min。加入150μL Solution III(5mol/L KAc 60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL)，剧烈摇动管子，冰浴3～5min。离心12,000×10min，将上清移至另一离心管，加入400μL异丙醇，室温放置10min。离心12,000×10min，弃上清，沉淀用70％冰冷乙醇洗涤后置于真空干燥器中干燥。最后加入20μL含RNase(50g/mL)的TE溶解沉淀，质粒溶液在4℃或-20℃保存，备用。
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PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购买自Generay)纯化后，EcoRI和XbaI
双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收后与经相同步骤处理的pYG858用Mighty Mix连接酶16℃连接30min，连接液加入E.coli.DH5α感受态细胞，冰浴30min后42℃热激90sec，37℃，120rpm孵育1h后离心12,000×1min，除去部分上清后涂布于LB(含100μg/ml的Amp)平板，培养15h，挑取阳性转化子接种于含有100g/ml Amp的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，提取质粒。质粒经EcoRI和XbaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证正确后送至上海睿迪生物科技有限公司测序。
[0045]结果：取1～2μL cDNA为模板进行SSADH基因的扩增，得到长度约为1500bp的片段(如图3)，随后用pMD19-T载体进行亚克隆并测序，提交GenBank数据库得到登陆号为KFH41773.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。与RNA-Seq序列比对后发现，cDNA序列基本相同，说明克隆到了SSADH的全长cDNA序列。另外本实验中得到的SSADH全长cDNA序列与GenBank公布的ATCC11550的SSADH序列存在两个碱基的改变，由GG变成AA，并且这种改变导致了相应氨基酸的变化，即由V变为M，如图4、5。
[0046]将SSADH基因的PCR产物用EcoRI和XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收后与经相同步骤处理的pYG858相连，构建质粒pJS581。构建的质粒pJS581经PCR验证后送至上海睿迪生物科技有限公司测序，SSADH测序结果与之前克隆得到的序列一致，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0047]实施例2表达SSADH的顶头孢霉菌株制备
[0048]A.顶头孢霉CPCC480085和CPCC480096菌丝体的培养和原生质体制备[0049](1)从斜面刮下适量CPCC480085和CPCC480096顶头孢霉菌孢子，分别接种于100mL YPS液体培养基(葡萄糖2％，酵母提取物0.5％，聚胨1％，MgSO4·7H2O 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.13％，pH7.0)中，28℃、230r/min振荡培养4～5d；(2)8000r/min离心15min收集菌丝体，用无菌水洗涤一次；(3)经0.22μm无菌滤膜过滤50mL DTT(5mmol/L)溶液，30℃、150r/min振荡孵育40min～1h；(4)8000r/min离心5min，用P Buffer(KCl 44.7g/L，MgCl2·6H2O 2.03g/L，CaCl2 2.78g/L)常温洗涤2次；(5)经0.22μm无菌滤膜过滤60mL Lysing酶解液(P Buffer配制，10mg/mL)，30℃、150r/min振荡孵育3～4h；(6)镜检，当大部分菌丝已释放原生质体时，加入4倍体积的P Buffer，用灭菌的装填脱脂棉的针筒过滤除去残留的菌丝体；(7)3000r/min离心5min，P Buffer洗涤2次，将原生质体悬浮于适量P Buffer中，使原生质体浓度大于108个/mL；(8)将CPCC480085和CPCC480096顶头孢霉菌的原生质体分装于1.5mL离心管中，每管100μL。
[0050]B.顶头孢霉原生质体转化及鉴定
[0051]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将构建的质粒转化顶头孢霉，实验步骤如下：[0052](1)加入10μg的质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；(2)加入900μL 30％的PEG6000/CaCl2溶液，25℃孵育15min。(3)6000r/min5min，尽量吸出PEG6000溶液，用P缓冲液洗涤1次；(4)将上述A步骤制备的原生质体分别重悬于100μL P Buffer，加入于45℃保温的上层软琼脂培养基中，于旋涡振荡器上轻轻振荡混匀，然后倾倒在再生平板上，迅速转动平板使软琼脂均匀覆盖在下层培养基表面；于28℃培养36h，覆盖含有博来霉素的NaCl软琼脂，使平板中博来霉素终浓度为3μg/ml，软琼脂凝固后，于28℃培养；(5)培养7d后分别挑取两种
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菌株博来霉素抗性转化子斜面培养，7d后提取基因组DNA进行PCR验证。[0053]实施例3SSADH基因转录和表达水平分析[0054]A.转录水平分析
[0055]顶头孢霉总RNA的提取：
[0056]将基础培养基(麦芽汁20％，麦芽糖4％，聚胨1％，p H 7.0，加纯化琼脂粉2％)斜面上刮下的顶头孢霉CPCC480085的孢子用玻璃珠或匀浆器打碎后接种于种子培养基(玉米浆6％，蔗糖3.5％，葡萄糖0.5％，甲硫氨酸0.05％，(NH4)2SO4 0.8％，CaCO3 0.5％，豆油2％，pH6.5)中，28℃、230r/min培养72h；以10％的接种量转接至发酵培养基(玉米浆10％，淀粉3％，糊精6％，葡萄糖0.5％，甲硫氨酸0.6％，尿素0.3％，KH2PO4 0.9％，MgSO4·7H2O 0.3％，(NH4)2SO41.3％，CaCO3 1％，微量元素溶液1％，豆油2％，pH6.2)，同样条件培养4d到7d，12000r/min离心10min收获菌体，生理盐水洗涤2次。微量元素溶液的配方为FeSO4·7H2O 0.8％，MnSO4·H2O 0.2％，ZnSO4·7H2O 0.2％，CuSO4·5H2O 0.2％，pH1.0。[0057]离心收集的菌体用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA。[0058]总RNA中DNA的去除：
[0059]在微量离心管中配制下列反应液：RNA样品20～50μg，10×DNase I 5μL，Recombinant DNase I 2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)20Units，DEPC-treatedwater(RNase-free,5U/μL)Buffer至总体积50μL。反应条件为：(1)37℃反应20～30min后，使用热处理法使Recombinant DNase I失活：加入2.5μL0.5M EDTA，混匀后80℃加热处理2min，用RNase Free dH2O定容至100μL。[0060](2)加入10μL 3M醋酸钠和250μL冷乙醇，-80℃放置2min，4℃、12000r/min离心10min，弃上清。(3)加入70％冷乙醇洗净，4℃、12000r/min离心5min，弃上清后沉淀干燥，用适量的RNase Free dH2O溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA，同时测定RNA浓度。
[0061]RNA逆转录合成cDNA：
[0062]使用Takara公司的PrimeScript RT Reagent Kit逆转录合成cDNA。反应体系为(10μL)：5×PrimeScript Buffer 2μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer(50μM)0.5μL，Total RNA<500ng，RNase Free ddH2O至总体积10μL。反应液配制应在冰上进行，反应体系可按需求相应放大，10μL体系可最大使用500ng的Total RNA。反应条件为：37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶的失活反应)。[0063]实时荧光定量PCR：[0064]设计的qPCR引物为：SSADH-F(5’-CTCGTTGATACCACCGAAGGGG-3’，SEQ ID NO：5)和SSADH-R(5’-GCCTGGCGGGGTAC TTCTTCTC-3’，SEQ ID NO：6)。[0065]按下列组分配制PCR反应液(冰上进行)：SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5μL，5’-SSADH(10μM)0.5μL，3’-SSADH(10μM)0.5μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O至总体积25μL。在25μL的反应体系中，cDNA模板的添加量通常在100ng以下。采用三步法进行PCR反应：95℃10min，95℃10sec，65℃15sec，72℃20sec，荧光检测一次，共40个循环。[0066]如图2所示，发现在发酵第4天到第6天高产菌中编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因转录水平比低产菌中高，说明高产菌在发酵第4天到第6天通过GABA支路提供了更多的NADPH，从而可能有更多的NADPH来参与半胱氨酸和缬氨酸的合成，为CPC合成提供充足的前体。
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B.SSADH基因过表达效果的检测
[0068]首先用MN公司大量质粒抽提试剂盒抽提pJS581质粒大量抽提，原生质体制备后取100ul原生质体加入90μg的质粒的标准来确定每次加入预先制备的原生质体中的质粒量。将转化后的菌体与软琼脂混合后涂布于再生培养基上生长。根据菌落的生长状况，在平板铺上含有博来霉素的上层软琼脂使其终浓度为3.0μg/ml。一般是在菌落生长24-36h后，可以看见较为稀疏的单菌落，但是背景菌落又不至于很明显，这个时候铺含有博来霉素的软琼脂最为适宜。铺完抗生素后，28℃培养，期间应每天都注意观察转化子是否出现以及生长状况。若有转化子一般7-10天后其基本生长良好，可挑取至含有3μg/ml博来霉素的基础培养基上，28℃恒温培养10-14d。将得到的所有转化子进行发酵培养，发酵第7天后经HPLC检测得到发酵结果，发现CPC发酵单位有所提高，证明了SSADH对CPC的上调作用。[0069]实施例4顶头孢霉的发酵和发酵产物的HPLC检测[0070]从培养10d的斜面上刮下适量孢子，以出发菌株CPCC480085为对照，含转化子的菌株为实验组，其中转化子1为转有质粒pJS581的顶头孢霉菌菌株CPCC480096，转化子2为转有过表达质粒pJS581的顶头孢霉菌菌株CPCC480085，分别接种于装有20mL种子培养基的250mL摇瓶中，于旋转式摇床培养3d，转速为230r/min，温度28℃。再以10％(v/v)的接种量转接至装量为20mL种子培养基的250mL摇瓶中，25℃，230r/min，培养7d。发酵液经普通滤纸、0.22μm过滤，收集滤液，稀释25倍后进行HPLC检测。使用的是Agilent 1260HPLC检测器，C18色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇：0.2％(w/v)磷酸二氢钠＝5:95，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL，分析时间10min。根据峰面积和标准品的有效含量计算出样品中CPC含量。
[0071]检测结果为，出发菌株CPCC480085的CPC产量为8.570mg/mL，以CPCC480096为出发菌株时，其CPC产量为8.601mg/mL，与CPCC480085为出发菌株的产量无明显差异。挑取的两个转化子1和2的CPC产量分别为10.647mg/mL和9.985mg/mL，如图6所示。由此可知，通过过表达SSADH基因，提高了CPC的产量。其中转化子1比对照组的产量高2.077mg/mL，p值为0.031，二者产量差有统计学差异；转化子2比对照组的产量高1.415mg/mL，p值为0.014，二者产量差有统计学差异。转化子1和2的CPC产量差为0.662mg/mL。[0072]应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
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SEQUENCE LISTING<110> 上海医药工业研究院;中国医药工业研究总院<120> 一种头孢菌素C的制备方法及其所用的基因工程菌<130> P1711627C<160> 6<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 493<212> PRT<213> Acremonium chrysogenum<400> 1Met Ala Ser Phe Pro Leu Ser Leu Arg Arg Pro Asp Leu Val Glu Ile1 5 10 15Arg Gly Leu Ile Asn Gly Glu Trp Ile His Pro Gly Asp Gly Glu Ser 20 25 30Phe Pro Val Tyr Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Ile Gln Asn Cys Pro 35 40 45Ser Phe Asn Ile Gly Asp Phe Arg Arg Ala Ile Asp Leu Ala Gln Ala 50 55 60Gly Phe Glu Asp Phe Ser Arg Ser Thr Thr Ala Lys Glu Arg Gly Ala65 70 75 80Leu Leu Arg Arg Trp Asn Asp Leu Val Leu Glu His Glu Glu Asp Leu 85 90 95Ala Arg Ile Leu Ser Leu Glu Asn Gly Lys Thr Leu Thr Glu Ala Thr 100 105 110Gly Glu Val Arg Tyr Ala Ala Ser Phe Ile Ser Trp Phe Ala Glu Glu 115 120 125Ala Thr Arg Ser Tyr Gly Asp Gln Ile Pro Ser Ser Tyr Lys Asn Ala 130 135 140Met Val Ile Thr Leu Lys Glu Pro Val Gly Val Cys Gly Ile Ile Thr145 150 155 160Pro Trp Asn Phe Pro Ala Ala Met Ile Thr Arg Lys Ile Ala Pro Ala 165 170 175Phe Ala Thr Gly Cys Ser Val Val Ile Lys Pro Pro Arg Glu Thr Pro 180 185 190Phe Thr Ala Leu Ala Leu Ala Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Ile Pro 195 200 205
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Pro Gly Thr Ile His Val Leu Pro Thr Lys Val His Lys Ala Ala Glu 210 215 220Glu Leu Ala Thr Asn Pro Lys Met Lys Lys Leu Ser Phe Thr Gly Ser225 230 235 240Thr Arg Val Gly Lys His Leu Thr Gln Leu Ala Ala Gly Thr Met Lys 245 250 255Lys Val Ser Met Glu Leu Gly Gly Asn Ala Ala Phe Ile Val Phe Glu 260 265 270Asp Ala Asp Ile Asp Leu Ala Val Glu Gly Ala Leu Ile Cys Lys Phe 275 280 285Arg Ser Ser Gly Gln Thr Cys Val Cys Ala Asn Arg Leu Leu Val His 290 295 300Arg Asp Val Ala Asp Asp Phe Thr Glu Lys Leu Ile Gln Arg Val Lys305 310 315 320Ala Met Arg Leu Gly Pro Gly Leu Asp Ser Lys Thr Thr His Gly Pro 325 330 335Leu Val Asn Ala Gly Ala Val Ala Lys Ile Lys Glu His Val Glu Asp 340 345 350Ala Val Ser Lys Gly Gly Val Val Lys Val Gly Gly Lys Val Pro Glu 355 360 365Gly Leu Asp Gly Gly Phe Phe Tyr Glu Pro Thr Val Ile Ser Asn Ala 370 375 380Thr Ala Asp Met Met Val Ala Tyr Asp Glu Thr Phe Gly Pro Leu Ala385 390 395 400Pro Val Phe Thr Phe Gly Asp Glu Asp Glu Ala Ile Ser Met Ala Asn 405 410 415Asp Thr Glu Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Phe Phe Ser Ala Asn Val Gly 420 425 430Arg Val Met Arg Val Ala Gln Arg Leu Gln Cys Gly Met Ile Gly Val 435 440 445Asn Thr Gly Leu Ile Ser Ala Ala Glu Ser Pro Phe Gly Gly Ile Asn 450 455 460Glu Ser Gly Val Gly Arg Glu Gly Ser Lys Tyr Gly Leu Ser Glu Tyr465 470 475 480Gln Asn Ile Lys Thr Val Thr Leu Gly Asn Leu Asp Lys 485 490<210> 2<211> 1541<212> DNA
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<213> Acremonium chrysogenum<400> 2atggcgtcct tcccgctgtc cctgagacgc cccgatcttg tcgagatccg cggcctcatc 60aacggggagt ggatccaccc cggcgatggg gagtccttcc ccgtctacga cccatccaac 120ggcaggacga tccagaactg ccccagcttc aacattggcg actttcggag ggcgattgat 180ctcgctcagg ctgggttcga ggacttctca aggtcgacaa ccgccaaaga aaggggagcc 240ctgctgcgga gatggaatga tctagtcctg gagcacgagg aagactgtaa gcactctccg 300acggcccgcc cctcgtgttg agaaccagaa agctcacggc tgcagtggcc agaatcctat 360ccttggaaaa cggaaagacc ctgaccgaag ccacgggcga agtccgctac gccgcctcct 420tcatctcctg gttcgccgag gaagccaccc gctcctacgg cgaccagatc cccagctcct 480acaagaacgc catggtcatc accctcaagg agccggtggg ggtctgcggc atcatcacgc 540cgtggaactt ccccgccgcc atgatcacgc gtaagatcgc acccgccttc gcgaccggct 600gctccgtggt catcaagcca ccccgcgaga cgccgttcac agcgctcgcg ctcgcaaagc 660tggccctcga ggcggggatc ccgccgggta ccattcacgt gcttccgacc aaggtgcaca 720aggcggctga ggagctggcg acgaatccca aggtgaagaa gctcagcttc acgggttcga 780cgagggtggg caagcacctg acgcagctgg ccgcgggaac catgaagaag gtcagcatgg 840agctcggtgg gaatgcggcg tttatcgtgt ttgaggatgc ggatatcgac ctggccgtcg 900agggcgcgct catctgcaag ttccgctcct cggggcagac ttgcgtctgt gcgaacagac 960tgctcgtgca tcgcgacgtg gccgacgact tcaccgagaa gttgatccag cgcgtcaagg 1020ctatgagatt aggcccgggt ctcgatagca agacgacaca cggtcccctc gtcaatgcag 1080gagccgtagc taagattaaa gagcacgtcg aggacgcggt cagcaagggc ggtgtggtca 1140aggtcggtgg gaaggtgcca gagggactcg acgggggctt cttctacgag cctacggtca 1200tttccaacgc cacggcggat atgatggtcg cgtacgatga gacatttggg cctctggctc 1260ccgtgttcac ctttggcgat gaggacgagg ccatatcgat ggccaacgat accgagttcg 1320gcctggcggg gtacttcttc tcggccaatg tcggtcgcgt catgagagtc gcgcagagac 1380tccagtgtgg tatgattggt gtcaacacgg ggctcatcag cgcggccgag tcccccttcg 1440gtggtatcaa cgagagtggc gtgggcaggg aggggagcaa atatgggttg agcgagtacc 1500agaacatcaa gacggtaaca ttgggtaact tggacaagta g 1541<210> 3<211> 36<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> SSADH-EcoR I<400> 3gcggaattca tggcgtcctt cccgctgtcc ctgaga 36<210> 4<211> 34<212> DNA
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<213> Artificial Sequence<220><223> SSADH-Xba I<400> 4ccgtctagac tacttgtcca agttacccaa tgtt 34<210> 5<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> SSADH-F<400> 5ctcgttgata ccaccgaagg gg 22<210> 6<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> SSADH-R<400> 6gcctggcggg gtacttcttc tc 22
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